miR-506-3p通过靶向IQGAP1基因抑制甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的体外研究

王小蕊 董非斐 何碧凝 黎克行

(三亚市人民医院内分泌科，海南 三亚 572000)

甲状腺癌是一种常见的内分泌恶性肿瘤，乳头状甲状腺癌(PTC)是甲状腺癌最常见的病理类型，约占所有甲状腺癌的80%〔1〕。近年来，随着甲状腺癌综合治疗技术的不断提高，大多数PTC患者预后良好，但局部复发和远处转移患者经临床治疗后预后效果较差〔2〕。因此，探索甲状腺癌发生发展的分子机制，寻求新的靶向治疗位点，对改善甲状腺癌患者的预后、提高其生存率具有重要意义。IQ结构域GTP酶激活蛋白(IQGAP)1是一种进化保守的多域支架蛋白，可参与调控细胞附着、细胞迁移、细胞外信号转导和细胞分裂等多种细胞过程〔3〕。有报道〔4〕称IQGAP1在PTC中表达上调，下调IQGAP1表达可明显抑制甲状腺乳头状癌细胞的增殖能力、迁移和侵袭。miRNA是多种细胞过程的重要调控因子，近年来的研究发现，异常表达的miRNA参与癌症的发生发展。有研究〔5〕表明，miR-506-3p在非小细胞肺癌组织和细胞中表达下调，过表达miR-506-3p可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。但尚无miR-506-3p在甲状腺癌中的相关研究，且miR-506-3p是否通过调控IQGAP1表达影响甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭目前尚不可知。本研究通过体外实验探讨miR-506-3p靶向IQGAPl表达对甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。

1 材料和方法

1.1材料与主要试剂、仪器 甲状腺癌细胞SW579、FTC-133、KAT-18和正常甲状腺上皮细胞TEC购于美国ATCC。胎牛血清(FBS)和RPMI1640培养基购于美国Gibco公司；LipofectamineTM2000转染试剂和TRIzol抽提试剂购于美国Invitrogen公司；PCR引物、miR-506-3p模拟物，miR-NC、si-IQGAP1载体、si-NC、WT-IQGAP1及MUT-IQGAP1由北京华大基因公司构建和测序；双荧光素酶报告基因检测系统购于美国Promega公司；细胞组织快速裂解液(RIPA)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western洗涤液及吐温-20购于上海碧云天公司；兔抗IQGAPl、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、P21、P27、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9和MMP-14抗体购于美国Santa Cruz公司；抗兔二抗购于武汉博士德公司。噻唑蓝(MTT)试剂、Transwell小室和酶标仪购自美国Thermo公司；荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，倒置显微镜购自日本Nicon公司。

1.2细胞培养与转染 选取甲状腺癌细胞株SW579、FTC-133、KAT-18和甲状腺上皮细胞TEC，在37℃，湿度饱和，CO2体积分数5%的细胞培养箱中，用含10% FBS RPMI1640培养基进行传代培养。取对数生长期的SW579细胞，以2×105个/孔细胞数接种于6孔板上，当细胞融合度达到50%时，按照LipofectamineTM2000说明书将miR-506-3p、miR-NC、si-IQGAP1、si-NC、pcDNA-IQGAP1和pcDNA转染SW579细胞。细胞分组为miR-506-3p组(转染miR-506-3p mimics)、miR-NC组(转染miR-NC)、si-IQGAP1组(转染si-IQGAP1)、si-NC组(转染si-NC)、miR-506-3p+pcDNA组(转染miR-506-3p和pcDNA)和miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1组(转染miR-506-3p和pcDNA-IQGAP1)。

1.3qRT-PCR检测 按照Trizol说明书分别提取甲状腺癌细胞株SW579、FTC-133、KAT-18和甲状腺上皮细胞TEC及各组SW579细胞的总RNA，检测其浓度和纯度后，逆转录为cDNAs，随后进行qRT-PCR扩增。引物序列如下：miR-506-3p正义：5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′；反义：5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′。U6正义：5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-A-3′；反义：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。IQGAP1-正义：5′-AGAACGTGGCTTATGAGTACCT-3′；反义：5′-CCAGTCGCCTTGTATCTGGT-3′。GAPDH正义：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′；反义：5′-CGCUUCACGAAUUUGCGUGUCAU-3′。miR-506-3p和IQGAP1 mRNA的检测分别以U6和GAPDH为内参，用2-△△Ct法测定miR-506-3p和IQGAP1 mRNA的相对表达量。

1.4MTT法检测细胞活力 取对数生长期SW579细胞，按照1.2细胞转染方法，获得各组转染细胞。分别于培养24、48、72 h时，每孔加入20 μl的MTT溶液室温反应4 h后，吸去孔内上清液，每孔再加入150 μl的二甲基亚砜(DMSO)，缓慢摇动5 min至完全溶解。用酶标仪在490 nm处测各孔的OD值(以空白孔进行调零)。

1.5Transwell法检测细胞侵袭和侵袭 取转染48 h的各组SW579细胞，胰酶消化后离心吸去上清，用无血清的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×105个/ml，于上室中加入200 μl细胞悬液，下室加入500 μl含10%FBS的RPMI1640培养基，将Transwell小室放置于37℃，5% CO2的细胞培养箱培养24 h后，擦去上室膜上未迁移的细胞，4%多聚甲醛固定下室膜10 min。自然晾干后，0.4%台盼蓝染色5 min。弃染液，双蒸水洗2次。取出后于倒置显微镜(40×)下观察拍照，统计上、下、左、右、中5个不同视野的总细胞数取平均值。

Transwell侵袭实验：将基质胶和RPMI1640培养基按1∶8稀释后(60 μl)铺于培养小室上，风干后备用，其他步骤同Transwell体外迁移实验。

1.6双荧光素酶报告基因检测 利用靶基因预测数据库Targetscan网站(http://www.targetscan.org/vert/)预测miR-506-3p的靶基因。发现miR-506-3p的5′端可与IQGAP1的3′-UTR特异性结合，猜测IQGAP1是miR-506-3p的靶基因。为验证这一猜想，构建野生型WT-IQGAP1和突变型MUT-IQGAP1的IQGAP1 3′-UTR荧光素酶报告载体。利用LipofectamineTM2000将miR-506-3p和miR-NC分别与WT-IQGAP1和MUT-IQGAP1共转染SW579细胞。转染48 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测定荧光素酶活性。

1.7Western印迹检测 收集转染48 h的各组SW579细胞，用RIPA裂解液裂解细胞，收集细胞总蛋白，并用BCA试剂盒进行蛋白定量。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白，将蛋白转至PVDF膜，用洗涤液洗膜2 min后加入吐温-20室温封闭2 h，吸尽封闭液后，在4℃下加入抗IQGAP1、GAPDH、CyclinD1、P21、P27、MMP-2、MMP-9和MMP-14一抗(1∶500)孵育过夜，用洗涤液洗膜3次后，在室温下用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶500)孵育膜2 h，洗膜3次后于暗室加入显色液进行显色并拍照，用Image Quant软件分析目的条带灰度值。以GAPDH作为内参。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-506-3p和IQGAP1在甲状腺癌细胞和正常甲状腺上皮细胞中的表达 与正常甲状腺上皮细胞TEC比较，甲状腺癌细胞SW579、FTC-133和KAT-18中miR-506-3p的表达均显著降低，IQGAP1 mRNA和IQGAP1蛋白的表达均显著升高(P<0.05)。见图1，表1。

表1 miR-506-3p和IQGAP1在甲状腺癌细胞和正常甲状腺上皮细胞中的表达

图1 IQGAP1蛋白表达

2.2miR-506-3p过表达对甲状腺癌SW579细胞增殖的影响 与miR-NC组比较，miR-506-3p组甲状腺癌SW579细胞中miR-506-3p的表达显著升高(P<0.001)，表明成功构建了过表达miR-506-3p的SW579细胞株。与miR-NC组比较，miR-506-3p组甲状腺癌SW579细胞在24 h的增殖活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力显著减弱，细胞增殖相关蛋白CyclinD1的表达显著降低，P21和p27蛋白的表达显著升高(P<0.001)。表明过表达miR-506-3p可抑制甲状腺癌细胞的增殖。见图2，表2。

图2 增殖相关蛋白表达

表2 miR-506-3p过表达对甲状腺癌SW579细胞增殖的影响

2.3miR-506-3p过表达对甲状腺癌SW579细胞迁移、侵袭的影响 与miR-NC组比较，miR-506-3p组甲状腺癌SW579细胞中迁移和侵袭细胞数均显著减少，侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9和MMP-14的表达显著降低(P<0.05)。表明过表达miR-506-3p可抑制甲状腺癌细胞的迁移和侵袭。见图3、表3。

图3 迁移侵袭相关蛋白表达miR-506-3p过表达对甲状腺癌SW579细胞迁移、侵袭的影响(结晶紫，×200)

表3 miR-506-3p过表达对甲状腺癌SW579细胞迁移、侵袭的影响

2.4抑制IQGAP1表达对甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响 si-IQGAP1组甲状腺癌细胞SW579中IQGAP1蛋白的表达较si-NC组显著降低(P<0.05)，表明成功构建了IQGAP1抑制表达的甲状腺癌SW579细胞株。与si-NC组比较，si-IQGAP1组甲状腺癌SW579细胞在24 h、48 h和72 h的增殖活力显著减弱，迁移和侵袭细胞数均显著减少，细胞增殖相关蛋白CyclinD1和侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达显著降低，P21蛋白的表达显著升高(均P<0.05)。表明抑制IQGAP1表达可抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。见表4，图4。

表4 抑制IQGAP1表达对甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

图4 IQGAP1和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.5miR-506-3p靶向调控IQGAP1的表达 miR-506-3p与IQGAP1-3′UTR之间存在特异性结合位点。野生型IQGAP1基因表达载体WT-IQGAP1和miR-506-3p mimics共转染甲状腺癌细胞SW579后，miR-506-3p组SW579细胞荧光素酶活性(0.42±0.04)与再转染miR-NC组(1.03±0.09)显著降低(P<0.05)；而突变型IQGAP1基因表达载体MUT-IQGAP1和miR-506-3p mimics共转染甲状腺癌细胞SW579后，miR-506-3p组SW579细胞荧光素酶活性(1.04±0.09)与再转染miR-NC组(1.05±0.08)差异不显著(P>0.05)。与miR-NC组(0.63±0.06)比较，miR-506-3p组SW579细胞IQGAP1蛋白的相对表达量(0.24±0.03)显著减低；与anti-miR-NC组(0.61±0.06)比较，anti-miR-506-3p组SW579细胞IQGAP1蛋白的相对表达量(0.96±0.08)显著升高(P<0.05)。见图5。表明在SW579细胞中，IQGAP1是miR-506-3p的靶基因，miR-506-3p可负性调控IQGAP1的表达。

1～4：miR-NC组，miR-506-3p组，anti-miR-NC组，anti-miR-506-3p组图5 miR-506-3p靶向调控IQGAP1的表达

2.6IQGAP1过表达逆转了miR-506-3p过表达对SW579细胞增殖、迁移和侵袭的作用 与miR-NC组比较，miR-506-3p组SW579细胞IQGAP1蛋白的表达显著降低(P<0.05)，在24 h的增殖活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力显著减弱，迁移和侵袭细胞数均显著减少，细胞增殖相关蛋白CyclinD1和侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达显著降低，P21蛋白的表达显著升高(均P<0.05)；与miR-506-3p+pcDNA组比较，miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1组SW579细胞IQGAP1蛋白的表达显著升高(P<0.05)，在24 h的增殖活力变化不明显(P>0.05)，在48 h和72 h的增殖活力显著增强，迁移和侵袭细胞数均显著增加，细胞增殖相关蛋白CyclinD1和侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达显著升高，P21蛋白的表达显著降低(均P<0.05)。表明过表达IQGAP1可逆转miR-506-3p过表达对SW579细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。见图6、表5。

1～4：miR-NC组，miR-506-3p组，miR-506-3p+pcDNA组，miR-506-3p+pcDNA-IQGAP1组图6 IQGAP1和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表5 IQGAP1过表达逆转了miR-506-3p过表达对SW579细胞增殖、迁移和侵袭的作用

3 讨 论

人类IQGAP蛋白家族包括IQGAP1、IQGAP2和IQGAP3 3个成员，其中IQGAP1已被证实广泛存在于人体组织中。作为支架蛋白，IQGAP1通过与各种效应因子或调节因子结合，在调控细胞骨架结构和细胞黏附方面发挥重要作用〔6〕。研究显示〔7～9〕，IQGAP1在肺癌、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌等多种癌组织和细胞中高表达，与癌症的侵袭转移密切相关。如IQGAP1在胰腺癌中明显上调，下调IQGAP1表达，可抑制胰腺细胞SW1990的增殖和转移，并抑制肿瘤的形成〔10〕。miR-506是灵长类动物睾丸X染色体连锁miRNA簇成员之一〔11〕，研究表明〔12〕，miR-506在不同类型的癌症中发挥不同的作用。如miR-506在黑色素瘤中起癌基因作用，过表达miR-506可促进黑色素瘤细胞的生长、侵袭和迁移。然而，过表达miR-506-3p抑制骨肉瘤细胞增殖、促进细胞凋亡〔13〕；过表达miR-506-3p也可抑制鼻咽癌细胞的生长和转移〔14〕。

本研究结果进一步验证了Su等〔15〕甲状腺癌细胞中IQGAP1高表达的结论。提示在甲状腺癌中，上调miR-506-3p或下调IQGAP1可能通过抑制CyclinD1、MMP-2、MMP-9和MMP-14蛋白表达，促进P21和P27蛋白表达抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这与Liu等〔16〕敲除IQGAP1基因可抑制甲状腺癌细胞侵袭的结论一致。双荧光素酶报告基因检测实验和Western印迹检测证实，IQGAP1是miR-506-3p的靶基因，miR-506-3p可负向调控IQGAP1的表达，这与Lin等〔17〕研究结果一致。转染成功构建的IQGAP1过表达载体pcDNA-IQGAP1后，发现miR-506-3p对甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用在一定程度得到逆转。提示miR-506-3p在甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程中发挥重要作用，miR-506-3p靶向调控IQGAP1表达参与其中。近年来，已发现miR-217、miR-539和miR-126等多种miRNA可通过下调其靶基因抑制甲状腺癌细胞的增殖和转移〔18～20〕。

综上，miR-506-3p可抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与miR-506-3p靶向下调IQGAP1有关，表明miR-506-3p可能是甲状腺癌的一个有效的治疗靶点。