生乳中嗜冷菌生长动力学模型的建立及应用研究

韩奕奕 杨晓君 马颖清 张维谊 王 霞 丰东升

（上海市农产品质量安全中心， 农业农村部食品质量监督检验测试中心 （上海）， 上海 201708）

嗜冷菌 （psychrotrophic microorganisms） 广泛存在于自然界中。 我国NY/T 1331—2007 《乳与乳制品中嗜冷菌、 需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》 中定义嗜冷菌为 “在6.5℃条件下， 需氧培养10 d， 在MPC 琼脂平板上形成可计数菌落的细菌、酵母和霉菌”[1]。 国际乳品联合会 （IDF） 将 7℃及以下依然能生长繁殖的微生物定义为低温菌； 在20℃及以下能生长繁殖， 且10～15℃为最适生长温度的微生物定义为嗜冷菌[2]。 生乳中嗜冷菌的来源较广， 菌株类型较多， 其中以假单胞菌、 微球菌和产碱杆菌数量居多[3～4]。 假单胞菌属主要存在于土壤、 淡水、 海水和许多植物体中； 微球菌分布较为广泛， 以空气、 水、 设备及动物体表居多； 产碱杆菌主要存在于水、 饲料及粪便中[5～6]。 在嗜冷菌的污染环节中， 接触传播是最主要的传播途径， 如挤奶工手的卫生、 药浴杯污染、 水清洗乳头污染、运输及储存设备的不清洁及消毒不严格等均容易造成嗜冷菌数量快速增长[7]。

生乳从收集到加工需要存放一段时间， 为了更好地控制微生物， 防止生鲜乳变质， 低温成为了保存和运输过程中必不可少的条件[8]。 低温能够抑制生乳中大部分微生物的活性， 但其中的嗜冷菌仍能在低温环境中繁殖[9～10]。 嗜冷菌在生乳没有及时冷却、 冷却温度不达要求或储存时间过长时， 就会大量繁殖， 并产生能分解脂肪、 蛋白质的耐热脂肪酶、 蛋白酶， 可导致原料乳在热灭菌后产生沉淀、凝胶， 变苦[10]， 使乳及乳制品风味、 品质降低， 保质期缩短， 造成产品品质缺陷[11～12]。 随着冷藏设备的广泛应用， 嗜冷菌逐渐成为影响乳制品保质期的主要因素[13]。 因此对生乳中嗜冷菌的控制目前越来越受到乳品生产企业的关注和重视。

目前， 我国还未对生乳中嗜冷菌设置限量要求。 GB 19301－2010 《食品安全国家标准 生乳》中仅对菌落总数作了明确规定 （2.0×106CFU/mL以下为合格乳）[14]。 国外对生乳中微生物指标要求更加严格， 欧美等国规定生鲜乳中微生物菌落数在1.0×105CFU／mL 以下， 同时嗜冷菌数控制在 1.0×103CFU/mL 以下为合格乳， 从而有效控制原料奶中某些嗜冷菌合成产物耐高温酶的含量[15～16]。 在乳品企业实际生产中， 根据原料乳品质等级， 嗜冷菌限量值一般保持在 1.0×103CFU/mL 以下[17]。 从 2005年起， 上海地区已将嗜冷菌作为生乳质量安全监控的指标之一， 列入生乳按质论价计价体系中[18]， 并于2020 年作为生乳按质论价收购的检测指标之一，其中规定嗜冷菌数≤103CFU/mL 时， 每千克奶价增加 0.03 元； ＞103且≤104CFU/mL 不奖不罚；＞104且≤105CFU/mL 则每千克扣 0.05 元； ＞105CFU/mL则每千克扣0.10 元。

预测微生物学是食品微生物学中的一个研究领域， 旨在提供数学模型来预测食品环境中的微生物行为[19～20]。 张宏伟等[21]对秋季低温储存原料乳进行预测微生物学研究， 使用Gompertz 模型建立4～14℃储存的秋季原料乳中总菌落和嗜冷菌的生长动力模型。 本文以上海地区生乳为研究对象， 应用预测微生物学建立嗜冷菌在不同温度下的生长动力学模型， 此模型能够有效地预测出生乳在生产加工、储藏和运输过程中嗜冷菌的变化情况， 为生乳中嗜冷菌的风险评估以及乳品安全生产加工和流通过程提供研究基础和理论依据， 为乳品生产企业建立微生物风险管理措施提供科学依据。

一、 材料与方法

（一） 样品的采集生乳取自上海地区规模化奶牛养殖场。 所有采样容器均为无菌容器， 样品采集后0～4℃冷藏保存后送实验室检测。

（二） 材料与仪器嗜冷菌菌种： 由日常生乳样品中分离培养获得； 乳平板计数琼脂 （MPC 琼脂， 北京陆桥技术股份有限公司）； 2， 3， 5－三苯基氯化四氮唑 （TTC， 国药集团化学试剂有限公司）； 灭菌处理生乳： 经过65℃下30 min 灭菌处理的生乳； 其他试剂均为分析纯。

AIRTECH超净工作台 （苏州安泰空气技术有限公司）； 低温培养箱 IPP400 （德国 Memmert 公司），6.5℃； LPVortexMixer 漩涡混合器 （美国 Thermo 公司）； HV－110高压灭菌锅 （日本HIRAYAMA 公司）。

（三） 实验方法

1. 样品处理。 从事先准备好的生乳嗜冷菌分离培养平板上挑取适量嗜冷菌， 通过对比麦氏比浊管浊度， 制备浓度约为0.5 麦氏浓度 （相当于1.5×108CFU/mL） 的嗜冷菌菌液， 通过无菌水逐级稀释， 随后将不同浓度的嗜冷菌菌液移取到灭菌生乳中， 使其终浓度分别为 10～102、 102～103、 103～104、 104～105CFU/mL， 并用平板计数法测定其嗜冷菌数 （即为初始浓度）， 以模拟不同嗜冷菌初始浓度的生乳试样。

2. 测定方法。 遵照 NY/T 1331－2007 《乳与乳制品中嗜冷菌、 需氧芽孢及嗜热需氧芽孢数的测定》， 对不同初始嗜冷菌浓度的生乳样品在不同储存温度和时间下的嗜冷菌数量进行测定。

3. 不同温度下生长曲线的测定。 将不同初始嗜冷菌浓度的生乳样品分别放置于4、 6.5、 10、14、 18℃下培养， 每 3 h 取样测试。 各温度、 浓度梯度的生乳样品， 根据其嗜冷菌污染情况， 选择3个适宜的稀释度， 每个稀释度移取1 mL 样液至无菌培养皿， 在6.5℃下培养10 d， 每个稀释度做2个平行， 本次嗜冷菌生长曲线实验共测试54 h。

4. 模型的建立。 预测微生物学是运用微生物学和统计学进行数学建模， 评估食品的安全性［22～26］。微生物生长动力学模型以数学公式的形式描绘了微生物的生长曲线， 很好地表达了微生物从生长到衰亡的过程中微生物数目 （细菌总数或当前存活细菌总数） 与生长时间的动态变化关系。 现有的微生物生长模型有 Logistic 模型、 Gompertz 模型、Baranyi 模型、 Huang 模型[27]等， 各模型是通过不同的分析方式对微生物生长初始经历迟缓期、 对数生长期， 直至稳定期的生长过程进行归纳总结后建立的。 Logistic 模型基本表达式见公式 （1）：

式（1）中，t为时间（h），Nmax为微生物最大生长量（CFU/mL），μmax为微生物最大生长速率 （h－1），λ为迟滞期时长 （h）， exp 为高等数学里以自然对数e 为底的指数函数。 应用Origin 软件绘图， 使用Logistic 函数模型建立牛乳中嗜冷菌的初级生长动力学模型。

二、 结果与分析

（一） 嗜冷菌生长动力学模型的建立图1～图4 分别为不同初始嗜冷菌浓度的生乳在不同储存温度条件下的生长模型， 结果显示， 不同初始嗜冷菌浓度的生长规律相同， 均是10℃的生长速率最高， 14℃和18℃的生长速率相近， 迟缓期到对数生长初期18℃的生长速率略高于14℃， 但对数生长中后期到稳定期变为14℃的生长速率略高于18℃， 4℃的生长速率最低， 这说明温度控制在4℃能较好地抑制嗜冷菌的生长。 图5～图9 为不同温度下， 不同初始嗜冷菌浓度的生乳中嗜冷菌的生长曲线， 结果表明， 初始嗜冷菌浓度越低， 达到稳定期后的嗜冷菌总数也越低。

图1 初始浓度为10～102CFU/mL 的生乳在不同储存温度条件下嗜冷菌生长情况

图2 初始浓度为102～103CFU/mL 的生乳在不同储存温度条件下嗜冷菌生长情况

图3 初始浓度为103～104CFU/mL 的生乳在不同储存温度条件下嗜冷菌生长情况

图4 初始浓度为104～105CFU/mL 的生乳在不同储存温度条件下嗜冷菌生长情况

图5 4℃下不同初始嗜冷菌浓度的生乳中嗜冷菌的生长情况

图6 6.5℃下不同初始嗜冷菌浓度的生乳中嗜冷菌的生长情况

图7 10℃下不同初始嗜冷菌浓度的生乳中嗜冷菌的生长情况

图8 14℃下不同初始嗜冷菌浓度的生乳中嗜冷菌的生长情况

图9 18℃下不同初始嗜冷菌浓度的生乳中嗜冷菌的生长情况

（二） 曲线的拟合表1 为嗜冷菌生长动力学模型方程及拟合度， 使用Logistic 模型建立的上海地区生乳中嗜冷菌生长动力学模型的R2＞0.99， 表明建立的4～18℃储存的生乳中嗜冷菌的生长动力学模型是合适的， 该模型可有效模拟上海地区生乳中嗜冷菌的生长情况。

表1 嗜冷菌生长动力学模型方程及拟合度

三、 嗜冷菌生长动力学模型的应用

（一） 上海地区生乳中嗜冷菌实测情况2019－2020 年度每旬对上海及周边地区奶牛养殖场运送至乳品加工企业的生乳中嗜冷菌进行监测， 共计检测样品3 413 批次， 测得生乳中嗜冷菌浓度范围在320～1.5×106CFU/mL， 均值为 1.25×104CFU/mL，中位数为880 CFU/mL。

（二） 模型的应用生乳储存开始时细菌的浓度对其繁殖速度有重要影响， 在较低储存温度下生乳中嗜冷菌是主要增长的微生物[28]， 虽然嗜温微生物生长缓慢， 但是嗜冷菌仍然相对较快地生长[29]。低温对嗜冷菌的抑制效果取决于生乳最初被污染的程度， 生乳储存温度对产品的质量有重要影响[30]。

运用前文建立的模型， 结合嗜冷菌中脂肪和蛋白分解酶的研究， 可对生鲜乳中嗜冷菌的限量标准进行研究。 另外也可以利用模型计算生乳的安全运输时间， 或者是为保证收奶时达到相应的限量要求， 可推算牧场需控制生乳中嗜冷菌的数量范围。以生乳中嗜冷菌检出的中位值880 CFU/mL 为例，全程4℃储存条件下运输样品， 假设从奶牛养殖场送至生产加工点平均花费时间约为20 h， 通过代入4℃嗜冷菌生长动力学模型中计算得出， 奶牛养殖场的生乳中嗜冷菌的初始浓度应控制在100 CFU/mL 以内； 反之按乳品加工企业内控指标嗜冷菌数＜104CFU/mL 的要求， 假设奶牛养殖场生乳中嗜冷菌初始浓度为103CFU/mL， 生鲜乳储运温度控制在 0～7℃内， 则应用初始浓度为 103～104CFU/mL 的模型方程计算， 需保证19 h 内到达乳品加工厂开展生产加工才能符合内控要求。

四、 结论

本文研究了温度对生乳中嗜冷菌生长动力学的影响， 模拟在不同储存温度下的嗜冷菌生长情况，使用Logistic 模型建立4～18℃储存的生乳中嗜冷菌的生长动力学模型， 模型相关系数均＞0.99， 可以用来预测微生物生长情况。 以上海及周边地区的奶牛养殖场的生乳为实例， 在实际生产中可以通过嗜冷菌的初始浓度推算出嗜冷菌的数量及运输距离和时间。 研究所建立的模型可为奶牛养殖场、 乳品生产加工企业及相关监管部门开展生乳中嗜冷菌监管及限量安全风险评估提供科学基础。