核酸适配体技术在海洋生物毒素快速检测中的应用

吴益春 王晓煜 苏 满 祝世军 周 勇 罗海军 郭海波

（1. 舟山市食品药品检验检测研究院， 浙江舟山 316012； 2. 浙江海洋大学， 浙江舟山 316022）

近年来， 我国沿海赤潮发生率显著上升， 平均每一年爆发的次数和累计面积都有增加[1]。 海水富营养化、 近海的氮磷量增加， 促进了某些有害藻类的生长繁衍[2]， 这不仅对海洋生物造成了极大威胁， 也对人类的身体健康构成了较大的危害[3]。

一、 海洋生物毒素概况

海洋生物毒素为海洋生物体内存在的一类高活性特殊代谢成分， 大多数具有剧烈毒性， 是海洋生物活性物质研究中进展最迅速的[4]， 其主要由藻类或浮游植物产生。 海洋生物毒素能够在滤食性软体贝壳类动物组织内蓄积。 海洋污染造成的海水富营养化利于有毒藻类的大量繁殖， 从而引发赤潮[5]。贝类通过滤食有毒的藻类， 经过生物累积构成贝类毒素， 这些贝类毒素作用于人类消化系统、 神经系统或心血管系统， 引起中毒， 威胁人类健康。 贝类毒素根据其化学结构可大致分为3 大类： 聚醚类毒素、 生物碱类毒素和多肽类毒素[6]。 按照毒性作用机制又分为4 大类： 腹泻性贝毒 （diarrhetic shellfish poisoning， DSP）、 麻痹性贝毒 （paralytic shellfish poisoning， PSP）、 神经性 贝毒 （neurotoxic shellfish poisoning， NSP）、 记忆缺损性贝毒 （amnesia shellfish poisoning， ASP）[7]。

（一） DSPDSP 的化学结构为聚醚或大环内酯化合物， 是一种脂溶性物质， 其广泛存在于软体贝类中。 DSP 被人体摄食后主要作用于酶系统， 主要症状为腹泻、 恶心、 呕吐等， 目前尚无有效的治疗药物。 在大多数贝类中， 大田软海绵酸 （OA）是DSP 的主要成分， 现已经证明其具有致癌作用[8]。

（二） PSPPSP 被公认为是目前世界上分布最广、 事故发生频率最高的贝类毒素。 PSP 主要由单细胞甲藻产生， 大致可分为3 类： 石房蛤毒素（saxitoxin， STX）、 新石房蛤毒素（neosaxitoxin，neo－STX）、 膝沟藻毒素 （gonyautoxin， GTX）。PSP 的化学性质非常稳定， 加热煮熟也很难分解毒素[9]。 PSP 是一种神经肌肉麻痹剂， 它对人体产生麻痹作用的机理是阻断神经细胞的钠离子通道， 造成细胞间物质传输障碍。 PSP 中毒会产生四肢肌肉麻痹、 头痛、 恶心等不良反应， 严重的会导致呼吸停止， 且目前没有对症解毒剂。

（三） NSPNSP 主要是由于贝类滤食短裸甲藻后富集至体内而产生的， 被食用后会产生以神经麻痹为主的中毒。 NSP 可通过两种方法对人体造成危害， 一种是由食用了被短裸甲藻赤潮污染的贝类引起的[10]， 主要症状为眩晕、 头部神经机能失调、身体冷热无常、 恶心、 呕吐； 另一种是接触了含有短裸甲藻细胞或其代谢物的海洋气溶胶颗粒引起的呼吸道中毒， 症状为气喘、 干咳等。

（四） ASPASP 是由多列拟菱形藻分泌产生的毒素， 其中引起中毒的成分是一种非蛋白氨基酸， 名为软骨藻酸（domoic acid，DA）， 具有强烈的神经毒性， 同时也是红藻氨酸受体的兴奋剂[11]， 能够牢固结合谷氨酸受体， 作用于兴奋性的氨基酸受体和突触传递素， 提高钙离子的渗透性， 使细胞长时间处于去极化的兴奋状态而死亡， 导致记忆功能的长久损害。

二、 核酸适配体

核酸适配体 （aptamer， 简称适配体）， 是指经过一种新的体外筛选技术——指数富集配体系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment， SELEX）， 在随机单链寡聚核苷酸文库中得到能特异结合蛋白或其他小分子物质的单链寡聚核苷酸， 可以是RNA 也可以是DNA， 长度一般为 10～80 个核苷酸[12～13]。 众学者利用该技术从人工合成的随机单链寡聚核苷酸序列文库中反复筛选， 得到了很多以高特异性、 高亲和力与各类靶标物质结合为特点的适配体， 如凝血酶适配体[14]、 血管内皮生长因子适配体[15]、 三磷酸腺苷适配体[16]、可卡因适配体[17]等。 适配体能通过芳香环、 π-π 堆积、 范德华力和带电基团之间的静电相互作用形成特殊的三维结构， 与靶分子特异性结合[18]。 适配体具有亲和力高、 特异性强、 成本低、 性质稳定、 靶分子范围广、 易化学合成、 易改造、 易标记等优点， 目前研究中常被用作分子识别元件[19]。 由于适配体是一段单链寡聚核苷酸， 本身不具备识别能力， 在适配体与靶分子物质特异性结合过程中无法产生可检测的物理化学信号， 因此， 对适配体进行筛选修饰或借助换能器， 将适配体的识别过程转变为易于识别检测、 可定量处理的信号[20]。

适配体作为一种新型的识别分子， 被誉为 “化学抗体”， 具有以下特点[21～22]：（1） 适配体与靶标结合的产物具有亲和性和特异性， 与抗体相差较小，解离常数Kd可达 nmol/L 甚至 pmol/L 数量级， 例如茶碱RNA 适配体对茶碱的亲和力比咖啡因强1万倍， 虽然它们的分子仅相差1 个甲基， 但仍能够表现出极佳的特异性[23]。 （2） SELEX 是一种体外筛选适配体的技术， 可以从随机单链寡聚核苷酸序列文库中筛选出特异性与靶向物质高度亲和的适配体。 （3） 所选适配体序列易于大批量合成， 也可通过PCR 技术进行大批量复制， 无需动物或细胞实验， 周期短， 成本低。 （4） 适配体的目标类型多，例如小分子的氨基酸、 核苷酸、 金属离子、 毒素、有机染料、 抗生素、 辅助因子， 或者大分子的生物， 如酶、 生长因子、 抗体、 核酸和蛋白质， 甚至是完整的病毒。 （5） 适配体不易受到外界影响， 在室温下可以长期贮存和运输； 作为寡聚核苷酸的适配体分子即使变性之后， 也可以在合适的条件下发生复性。 因此， 以适配体作为识别分子的生物传感器能够反复利用[24]。 （6） 适配体有利于标记和化学修饰， 可随时将官能团引入随机单链寡聚核苷酸序列文库， 也可在化学合成过程中进行官能团的标记， 方便其检测应用。 （7） 适配体的相对分子质量较小， 不具有免疫原性， 而且组织穿透力强， 可以渗透入细胞， 获得更多的表相， 可应用于药物输送、 分子成像和细胞内诊断等。 （8） 适配体的二级结构容易被预测， 使用核酸酶等工具酶对其进行裁剪、 切割、 改造， 提高其亲和力和特异性， 有助于发展多元化的检测方法。 细菌和细胞等也可作为适配体筛选的靶标。 抗体和适配体的比较见表1[25]。

表1 抗体和适配体的比较

三、 核酸适配体技术在海洋生物毒素检测中的应用

海洋生物毒素检测方法主要包括： 小鼠生物检测法、 免疫分析法、 大型仪器检测法和毛细管电泳法。 小鼠生物检测法是依据小鼠被注射毒素后的存活时间和症状来评估毒性[26]。 该方法简单易行， 适用范围大， 但只能测定毒素的毒性， 无法确定含量， 可重复性差， 难以大规模推广。 免疫分析法是通过毒素抗原和抗体结合形成免疫复合物的性状和活性特点对样品中的毒素进行定性、 定位和定量检测， 检测灵敏度高， 检测迅速， 但抗体制备困难，不宜长期贮存。 大型仪器检测法包括高效液相色谱法 （HPLC）、 液相色谱－串联质谱法 （LCMS/MS） 等。 HPLC 是基于样品提取物的纯净度，运用高效液相色谱仪分离样品， 再通过紫外吸收检测、 电化学检测和荧光检测等方法进行分离， 能够准确定量检测毒素， 灵敏度高， 具有较高的可靠性， 但操作复杂， 所需设备较多， 无法进行实时检测[27]。 LC－MS/MS 可以高灵敏度识别毒素， 目前已广泛用于海洋生物毒素分析， 但它需要复杂的仪器和具有很强的操作能力的专业人员。 毛细管电泳法[28]是以弹性石英毛细管为分离通道， 以高压直流电场为驱动力， 根据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法， 该方法检测速度快、 高效， 但干扰因素多， 仅能用于毒素的实验室定量检测。 综上所述， 现有的海洋生物毒素检测方法都具有一定局限性， 寻找一种简单方便、 灵敏度高的快速检测方法成为当务之急。 以下是目前已经报道的海洋生物毒素适配体序列、 亲和力等信息及其筛选方法 （见表2）。

表2 目前已经报道的海洋生物毒素适配体序列、 亲和力等信息及其筛选方法

石房蛤毒素 （STX） 是水产品质量和安全检测中最重要项目之一[29]。 就现阶段来看， 该毒素主要采用小鼠生物检测法和免疫分析法[30]。 在2012 年，HANDY 等[31]首次报道了筛选STX 特异性适配体的研究， 第一次将核酸适配体技术应用于海洋生物毒素检测研究。 由于STX 相对分子质量小， 与核酸分子结合较难， 因此在该研究中引入了一个载体——KLH， 形成了 STX－Jeffam－ine－KLH 复合物， 进而通过SELEX 技术对适配体序列进行筛选， 经过10个循环的筛选， 最终得到了单一的高特异性的核酸序列——适配体APTSTX1。 进一步研究发现， 该适配体能稳定、 高特异性地结合STX。 2013 年，HU 等[32]又通过 SELEX 技术筛选出了STX 抗体分子的高特异性适配体F3， 它不会和其他毒素结合，可成为STX 的替代品， 解决了STX 分离纯化难的问题， 满足了逐渐发展的STX 检测技术对大量标准毒素的需求。 近年来随着对STX 适配体的研究越来越深入， 逐渐地从序列的获取转变为对序列的进一步修饰， 进而改变其二级结构， 这一技术能够极大地提高结合力和特异性。 2015 年， ZHENG等[33]在HANDY 等的基础上对原有的适配体进行了基因定点诱变和敲除等改造， 得到了一个新的适配体， 这个新的适配体对STX 的亲和力更高， 比原来的适配体APTSTX1 亲和力高出30 倍。

膝沟藻毒素 1/4 （GTX1/4） 是麻痹性贝类毒素， 含量较低， 但毒性剧烈， 无法利用常规手段检测[34]。 由于存在结构相似但功能不同的同类物 （如GTX2/3、 STX、 neo－STX 等）， 传统的小鼠生物检测法特异性差， 假阳率高， 无法快速高效地检测[35]。2016 年， 焦炳华和王梁华教授课题组[36～37]改进了传统的 MB－SELEX 技术， 采用了新型 GO－SELEX 技术来筛选获得GTX1/4 适配体。 经检测证明， GO－SELEX 技术与 MB－SELEX 技术相比，能获得更多克隆的适配体序列， 所获得的产物对于GTX1/4 有更好的特异性， 利用该技术筛选出GTX1/4 的新型适配体 GO18－Td[37]。 通过生物素－链霉素耦合的方法， 加工成BLI 适配体传感器， 并与生物膜干涉技术联用， 用于GTX1/4 的实际检测。 该传感器能够稳定检测的浓度范围是0.2～200.0 ng/mL， 检测的最低值达 50 pg/mL， 且不和其他类海洋生物毒素样品发生交叉反应， 特异性极高。

大田软海绵酸 （OA） 是腹泻性贝类毒素中的主要成分。 目前主要采用小鼠生物检测法作为OA的标准检验方法[38]， 但局限性强。 EISSA 等[39]利用SELEX 技术筛选出OA 的第一个特异性适配体。他们将OA 与磁珠进行孵育， 再以磁珠为介质与预先建立的随机核酸分子库结合， 4 个循环后， 采用反向筛选的方式将其中未和磁珠结合的非特异性核酸片段排除， 最终成功筛选出OA 的高特异、 高亲和核酸适配体OA34。 利用OA34 构建基于EIS 检测的无标记适配体传感器， 该传感器能检测的范围为 0.1～60.0 ng/mL， 最低检测限为 70 pg/mL[40]。

短裸甲藻毒素 （BTX） 是一种经典的神经性贝类毒素， 致死性极强， 小鼠腹腔注射LD50为200 mg/kg[41]。 为提高对该毒素的检测水平， 2014 年EISSA 等[42]通过SELEX 技术筛选出了具有高亲和性的适配体BT10， 经过一系列实验， 最终确定了适配体与BTX 的最佳孵育条件， 即30 min、 pH7.5、C（Mg2+）＝10 mmol/L。 在此条件下筛选得到的适配体有更高的亲和性和灵敏度， 最终可以加工成无标记的适配体传感器， 该传感器的检测最低浓度为106 pg/mL。 而且， BT10 也具有较高的特异性， 与BTX 的 2 个同类物 BTX－2、 BTX－3 有很高的亲和力， 而与所检测的其他海洋生物毒素无交叉反应。 2016 年， TIAN 等[43]通过 12 轮筛选获得适配体 Bap5， 与适配体 BT10 相比， Bap5 对 BTX－2具有更高的亲和性， 不和其他类海洋生物毒素样品发生交叉反应， 适合开发为BTX－2 检测试剂盒。

核酸适配体技术在检测海洋生物毒素方面具有操作简单、 灵敏度高、 选择性好、 检测成本低的优点， 基于其高灵敏度和稳定性， 可以开发出多种检测试剂盒和试纸。 近年来， 有众多学者选择研究海洋生物毒素的特异性适配体， 使得核酸适配体技术在海洋生物毒素检测领域获得长足的发展（见表3）。

表3 基于核酸适配体检测海洋生物毒素

四、 结语

海洋生物毒素是一种具有剧烈毒性的物质， 对人体健康造成严重危险。 因此， 开发一种能够快速检测海洋生物毒素的方法变得十分迫切。 核酸适配体技术作为一种新型的海洋生物毒素检测方法， 虽然在灵敏度方面不如大型仪器检测法， 但相比其他检测技术， 具有操作简单、 快速、 成本低， 不需要对被测样品进行复杂的预处理， 更不需要昂贵的仪器和专业的操作， 其灵敏度完全能满足日常检测的需要， 是一种非常有前景的检测技术。

就现在而言， 基于核酸适配体技术的检测基本还是以定性为主， 研发出稳定、 高灵敏度、 高通量、 可现场定量的检测技术就显得极为重要， 是未来的发展方向。