远缘杂交转育抗烟草花叶病N基因同源基因片段的初步研究

焦芳婵， 童治军， 方敦煌， 肖炳光， 袁欣婕， 陈学军， 李永平

(1.云南省烟草农业科学研究院， 昆明 650021；2.江西省农业科学院蔬菜花卉研究所， 南昌 330200)

普通烟草花叶病(Tobacco mosaic virus，TMV)是云南等烟叶主产区分布广、为害重的主要病害之一[1]，TMV广泛存在于活体寄主、植物残体、大田土壤，即使在低温和高温条件仍能保持一定的病毒侵染活力[2]，而且其寄主范围非常广，能侵染茄科(烟草、番茄、茄子)、葫芦科(西瓜)、十字花科(油麦菜)等[3]。

选育抗TMV的品种，是应对TMV为害最为经济和有效的手段。野生烟草-心叶烟中含有显性单基因TMV免疫基因N，前人已将N基因转育到了栽培烟草，N基因也是人类首次克隆的植物抗病基因[4]。我国利用该抗源已选育10多个高抗TMV的烟草品种[5-9]，但由于连锁累赘的存在，迄今仍没有适宜的高抗TMV的烤烟品种进行大规模推广种植[10]。除了利用烟草基因组序列数据设计引物，从大批量的杂交后代筛选短的抗TMV片段外[11]，从野生烟草资源中，转育新的TMV抗源也是应对措施之一。Yuan等[12]报道，在圆锥烟草(N.paniculataPI 555550)等烟属野生种中，其高抗TMV的特性由N基因家族其他成员提供。但迄今尚未见N基因同源基因片段(简称N同源片段，下同)转入栽培烟草的报道。本试验利用烤烟品种红花大金元与圆锥烟草(N.paniculata)开展种间远缘杂交研究，以期将新的TMV抗性基因导入栽培烟草，创制新的抗病种质资源，为选育抗TMV的烟草品种提供材料与数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

所用材料为烤烟主栽品种红花大金元(简称HD，染色体2 n=48)、圆锥烟草(N.paniculataPI 555550简称Np 555550，染色体2 n=24)、含有N基因的栽培烟草RBST及野生烟草(N.glutinosa)由云南省烟草农业科学研究院提供。

1.2 杂 交

分别以HD、Np 555550做父母本，进行正反杂交，每个组合进行20个左右杂交，以纸管法套袋，一周后统计杂交结实率(即坐果数与杂交花的比值)。

1.3 杂交种SSR及GISH分析

以QIAGEN DNeasy plant kit试剂盒提取杂交种及双亲DNA。SSR-PCR扩增体系为20 μL，其中DNA样品1.5 μL(15～30 ng·μL-1)、10×PCR Reaction Buffer(Mg2+plus)2 μL、25 mmol·L-1dNTPs 1.2 L、10 μmol·L-1正、反向引物各2 μL、rTaq0.75 U，最后加水至20 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共计30个循环。参照Bindler等[13]、童治军等[14]所用SSR引物表，筛选10对SSR引物进行SSR分析。

基因组前处理，液氮研磨提取体细胞杂交种基因组DNA，用Hind Ⅲ酶切纯化，用ROCHE的DIG HIGH PRIME DNA标记试剂盒对基因组进行地高辛标记。GISH分析参照Mark W.Chase等[15]的方法进行标记探针、压片、烘片、制片预处理、洗脱等处理。

1.4 Np基因特异标记开发及杂交种的抗性鉴定

参照Lewis R.S等[10]及Yuan等[12]的方法，分别合成N基因及Np基因特异引物，其中Np基因特异引物经过PCR筛选，选定solo-F 1-TGATGCACAAAGATCCCGTT+solo-R 2-GACCTCTGTGCATTCATCTTATCA为Np基因特异引物。以双亲及杂交种、RBST及N.glutinosa为模版，进行N基因片段及Np基因片段PCR扩增。

1.5 TMV接种抗性鉴定

参考周文兵等[16]的方法，即半叶枯斑法接种TMV，在25 ℃温室自然光照下，以10 mg·mL-1的0.2 mL花叶病病毒汁液摩擦接种半叶，另外一半涂去离子水(ck)，共接种6片叶子，观察杂交种是否有枯斑来判定抗病性。

2 结果与分析

2.1 Np 555550和HD的远缘杂交

以HD及Np 555550为双亲，通过正、反交两种方法进行杂交(见表1)。由表1可以看出，染色体数目多的栽培烟草红大为母本，其杂交结实率为0，而以圆锥烟草为母本，其杂交结实率达36.8%。

表1 红花大金元及圆锥烟草N.paniculata(PI 555550)杂交结实结果Table 1 Fruiting results of cross between N. tabacum (Honghuadajinyuan) and N. paniculata (PI 555550)

2.2 杂交种的SSR及GISH鉴定

10对SSR引物中，TM 100有稳定的扩增效果，其序列为：TM 100 F 5’-TGGAGGAACCAACAAGGAAG-3’及TM 100 R 5’-GTCCGACAGTATCTTCGCAA-3’。远缘杂交种F1含双亲带(图1)。

F1杂交种的GISH鉴定表明，母本用地高辛标记，用Rhodamine anti-DIG-sheep显红色荧光，父本用生物素标记，用Alexafluor 488 Streptavidin显绿色荧光，母本父本重合的染色体是黄色荧光。红色荧光共计8条，绿色荧光共计4条，黄色荧光(红绿重合)共计28条，总染色体条数共计40条(图2)。

2.3 Np基因特异标记开发及杂交种的抗性鉴定

N基因片段及Np基因片段PCR扩增结果(图3～图4)表明，圆锥烟草及杂交种不能扩增出540 bpN基因特异片段，而可以扩增出500 bp大小的Np基因片段。

对红花大金元、N.paniculata及其F1苗期人工接种TMV，接种7 d后，红花大金元出现花叶症状，N.paniculata和杂交种全部为枯斑、对TMV表现免疫(表2、图5)。

表2 杂交种TMV抗性鉴定结果Table 2 Identification of TMV resistance of hybrid

3 讨 论

截止2017年，国内烟草相关研究单位对2 000余份种质资源(包含重复鉴定资源)开展过TMV抗性鉴定[14-22]，其中大部分表现枯斑的烟草资源包括烤烟、白肋烟、香料烟、晒烟、雪茄烟，不包括黄花烟、野生烟等[11]，且这些资源的抗性都来自于N基因。目前国内外利用抗TMV资源选育的抗TMV烟草品种因为连锁累赘，在生产上的推广年限不长、推广面积不大。寻找新的TMV抗源是势在必行，而在野生烟草中具有普通烟草所不具有的一些重要基因，尤其是抗病抗虫基因。

Yuan等[12]研究表明，N.paniculata烟草中Np基因(GenBank:KP 278475)编码区有3 393个核苷酸，与N基因的编码区序列有205个SNPs差异，一个8核苷酸的缺失和一个3核苷酸的插入，核苷酸一致性为93.9%。Np基因中8核苷酸的缺失导致其后11个氨基酸序列与N蛋白中的序列不同。在203个位于8核苷酸缺失前的SNPs中，有137个引起氨基酸替换。203个SNPs中23个位于LRR区域内的高度变异位点，其中21个引起氨基酸的替换。其余116个位于8核苷酸缺失前的非同义突变SNPs分布于不同的区域：14个位于TIR区域，34个位于NBS区域，27个位于LRR区域，41个位于其他区域。N基因与N同源片段的高度变异位点的Ka/Ks比值为1.87，说明这两个基因在N.glutinosa和N.paniculata物种分化后受到了多样化选择。本研究以圆锥烟草为母本，将圆锥烟草的N基因同源基因Np片段转育到栽培烟草红花大金元中，为烤烟抗病育种提供了新的种质材料。

H.C.Sharma[17]在其他作物的远缘杂交结果表明，远缘杂交由于亲本间的基因组成存在较大差异，杂种一般以染色体数较多或染色体倍性高的作母本，更易克服杂交障碍获得远缘杂交种。本研究以染色体数少的圆锥烟草为母本，栽培烟草为父本也同样获得了杂交种，但其具体的分子机理有待下一步开展深入研究。另外，N基因同源基因Np片段导入栽培烟草后，其是否也存在较大的连锁累赘，是否也对烤烟产质量有较大的影响，仍有待下一步开展回交转育后进行比较分析。