引发对自然老化甜菜种子活力及幼苗生理特性的影响

荆文旭, 魏 磊, 万 雪, 石鑫鑫, 郭 明, 邢旭明, 史树德

(内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019)

amylase activity

种子活力是衡量种子品质的重要指标，在农业生产中受诸多因素影响，种子贮藏时自然发生的老化便是其中之一。随着自然老化时间的延长，种子活力及抗逆性会出现不同程度的下降[1]，因此如何解决自然老化后种子活力下降的问题至关重要。种子自然老化后，可通过人工辅助修复对其内部进行一系列结构和功能的有效恢复，从而达到提高种子活力的目的[2]，由Heydecker等[3]首先提出的种子引发技术是有效方式之一。该方法利用引发剂对细胞膜系统、内含物含量、酶活性及代谢产生影响而提高种子活力及其抗逆性。在此阶段植物细胞膜、细胞器和DNA都能得到充分修复，呼吸酶类得到充分活化[4]。引发处理后的种子播种后，会迅速越过萌动阶段，达到提高种子活力的目的。

甜菜(BetavulgarisL.)是内蒙古地区特色经济作物之一，在内蒙古区域经济结构优化调整以及中东部冷凉地区农民脱贫致富中占有重要地位[5]。但当前甜菜生产上种子严重依赖进口，且不耐贮藏，一般进口种子第二、三年萌发缓慢且抗逆性弱，种子活力较当年下降30%～50%，常给企业和农户带来较大的损失，不利于甜菜产业的发展。种子引发技术可以不同程度提高作物和牧草[6]等种子活力、出苗整齐度、幼苗健壮程度以及植株抗逆性，但对于自然老化甜菜种子活力提高的方法研究则未见报道。

本试验以自然老化的甜菜种子为研究材料，研究经不同引发剂的不同处理后种子活力和幼苗生理指标的变化，以期筛选出提高老化甜菜种子活力的最佳引发剂种类及其处理浓度，为甜菜种质资源保存、老化种子的再次利用及老化修复研究提供理论基础。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

以自然条件下保存12年的法饲一号甜菜为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1引发处理

用不同引发剂处理老化甜菜种子，每种引发剂设置不同浓度，将室温条件下浸种24 h后的老化甜菜种子，用蒸馏水冲洗数次后放置烘箱内30 ℃烘干至原始重量备用。引发剂种类分别为H2O(T)、H2O2(H)、PEG-6000(P)、壳聚糖(CH)、CaCl2(Ca)、GA3(G)、AsA(A)，以未经任何处理的自然老化甜菜种子为对照(ck),引发剂浓度与时间设置如表1所示。

表1 不同引发剂处理方式

1.2.2发芽指标测定

将处理后的甜菜种子每30粒均匀摆放已提前放置好2层充分湿润滤纸的培养皿中，3次重复，培养皿在人工气候培养箱中25 ℃恒温培养，培养至第7天时结束，注意培养皿中水分，防止因为水分过多或过少影响种子发芽。每隔24 h记录发芽的种子数，结束培养时计算每个培养皿发芽幼苗的平均长度，计算种子发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数，计算公式如下：

发芽势(%)=(第3天正常发芽种子粒数/供试种子总粒数)×100%[7]；

发芽率(%)=(第7天正常发芽种子粒数/供试种子总粒数)×100%[8]；

发芽指数=∑(Gt/Dt)，式中：Gt为当天发芽数；Dt为发芽日数[8]；

活力指数=S×GI[8]，式中：S为幼苗平均长度(mm)；GI为发芽指数；

平均发芽天数=∑(D×n)/∑n，式中:D为从种子置床起算的天数；n为相应各天的发芽粒数。

1.2.3生理指标测定

生理指标测定分两部分，一是将处理好的甜菜种子每9粒放置培养钵(d=10 cm)培养，基质为甜菜育苗专用营养土，每个处理3次重复，培养至第7天进行生理指标的测定。相对电导率采用电解质外渗量法[9]测定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[9]测定；可溶性蛋白采用考马斯亮蓝G-250染色法[9]测定；超氧阴离子(O2·-)含量使用索莱宝试剂盒测定。二是结合种子活力指标筛选出来每个试剂最佳处理，将其浸种过的种子放置培养皿中，培养条件同发芽指标测定相同，在萌发的第2天、第3天、第6天采用DNS法[9]进行测定α-淀粉酶活力、β-淀粉酶活力。

1.3 统计分析

用Excel 2019软件进行数据处理和制图，采用SPSS 23.0软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同引发剂对老化甜菜种子活力的影响

由表2可知，引发剂种类及其浓度的不同，对老化甜菜种子的萌发指标均有不同程度的影响。4种浓度的壳聚糖和GA3均能显著(p<0.05)提高老化甜菜种子发芽势、发芽率、发芽指数，同时降低其平均发芽天数。纯水处理中，以浸种12 h引发效果最好，发芽率较ck增加了100%；化学试剂处理中，分别以0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%壳聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA引发效果最好，发芽率较ck分别增加了130.06%、80.02%、520.07%、160.04%、330.06%、119.98%。平均发芽天数除H2O2和纯水处理较ck无明显下降外，其他各个处理的平均发芽天数均较ck显著(p<0.05)减少。

表2 不同引发剂对老化甜菜种子活力的影响

由表3可知，将每种试剂最优处理方式比较后发现，引发效果最好的处理是1.0%壳聚糖，其发芽势、发芽率和活力指数较ck提高了916.19%、520.07%、877.27%，平均发芽天数减少了1.39 d，表明该处理可以显著(p<0.05)提高种子活力，幼苗生长势较强。其次是250 mg·L-1GA3，在显著(p<0.05)提高种子发芽势、发芽率、发芽指数以及活力指数的同时，也显著(p<0.05)减少平均发芽天数。

表3 各试剂最优处理对老化甜菜种子活力的影响

2.2 不同引发剂对甜菜生理指标的影响

2.2.1不同引发剂对甜菜幼苗MDA含量、相对电导率、O2·-含量的影响

由表4可知，未引发处理直接播种的老化甜菜种子(ck)MDA含量、O2·-含量及其电导率值均为最大值，经不同引发处理后的老化甜菜种子均得到了不同程度的下降，说明引发对幼苗细胞膜系统有一定的修复作用。在不同时间纯水处理中，以浸种12 h引发处理效果最好，在不同的化学试剂处理中，分别以0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%壳聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA对细胞膜系统起到的修复效果最好。

表4 不同引发剂对甜菜幼苗MDA含量、相对电导率、O2·-含量的影响

由表5可知，每种试剂最优处理对比发现，各个最优处理较ck都起到了显著(p<0.05)的引发效果，其中效果最好的是1.0%壳聚糖溶液，MDA含量较ck下降了75.10%，O2·-含量较ck下降了42.29%，电导率较ck下降了46.12%，其次是250 mg·L-1GA3，MDA含量较ck下降了69.95%，O2·-含量较ck下降了38.17%，电导率较ck下降了45.99%。电导率降低表明细胞膜系统伤害得到修复或提高了膜系统完整性。

表5 各试剂最优处理对甜菜幼苗MDA含量、相对电导率、O2·-含量的影响

2.2.2不同引发剂对甜菜幼苗可溶性蛋白含量的影响

由图1可知，经不同引发处理后的幼苗可溶性蛋白含量较ck都有不同程度提高，且处理不同所呈现的效果也不同。其中，以250 mg·L-1GA3处理后可溶性蛋白含量最高，为16.43 mg·g-1，较ck增加了115.90%；其次是1.0%壳聚糖可溶性蛋白含量为14.54 mg·g-1，较ck增加了91.06%。可溶性蛋白质含量的提高，表明种子经过引发后，幼苗体内参与各种代谢的酶类增加和渗透调节蛋白发挥作用，幼苗生长潜力和抗逆性增强。

2.2.3不同引发剂对老化甜菜种子淀粉酶活力的影响

由图2可知，α-淀粉酶活力总体呈上升的趋势，经不同引发剂处理后的α-淀粉酶活力较ck都有不同程度的提高，其中以250 mg·L-1GA3处理的活力最高，第6天酶活力较ck增加了155.37%，其次是1.0%壳聚糖，第6天α-淀粉酶活力较ck增加了115.30%，25% PEG-6000和12 h水浸种处理虽然对α-淀粉酶活力有提高的作用，但无论是增高幅度及酶活力大小都不如其他几个处理显著(p<0.05)。

由图3可知，随着萌发时间的增加，β-淀粉酶活力整体呈上升的趋势，在第6天时，各处理酶活力均达到最大值。经引发剂处理后的β-淀粉酶活力均高于ck，第6天12 h纯水处理后的β-淀粉酶活力虽然显著(p<0.05)高于其他处理，但与第2天及第3天的酶活力综合分析后发现，经250 mg·L-1GA3处理后的活力最高，从第2天起活力均高于其他处理，其次是1.0%壳聚糖处理后的种子酶活力，这一结果与α-淀粉酶活力的变化趋势相同，说明这两个处理对于老化甜菜种子淀粉酶活力的提高起到了良好的促进作用。其他处理如100 mg·L-1AsA以及1.5% CaCl2对种子的淀粉酶活力的作用虽不如上述二者显著(p<0.05)但也能使其活力得到较为明显的提高。该实验结果表明，不同引发剂和浓度的处理，在提高促进种子萌发的淀粉酶活力方面差异显著，可指导开发生产上应用的自然老化甜菜种子引发技术，并且2种淀粉酶活力可作为种子是否被有效引发的指标。

3 讨 论

甜菜种子收获后随着贮藏时间的增加会出现种子老化，带来的影响反映在种子活力及后续的生理生化特征中[10]。沙红等[11]研究表明，人工加速老化的甜菜种子经不同处理引发后，种子活力能得到不同程度的提高，说明引发对人工老化甜菜种子能够起到一定的修复作用。本试验结果表明，自然老化甜菜种子经不同引发剂处理后，同样可以提高种子活力及其抗逆性。

3.1 甜菜种子自然老化的生理机制

在种子贮藏过程中，活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的产生是导致种子老化的主要原因，其中O2·-是ROS中起主要作用的物质。在种子萌发过程中，O2·-含量的增加会导致细胞膜发生脂质过氧化从而产生MDA，最终造成细胞膜透性增大，使相对电导率上升[12]。本研究表明，通过引发可以在一定程度上减少O2·-的产生，从而使MDA含量和相对电导率下降，最终使甜菜幼苗抗逆性增加。不同引发处理中，壳聚糖和GA3对O2·-含量、MDA含量及相对电导率降低效果显著(表4)，对细胞膜透性能起到一定的修复作用。

可溶性蛋白可以通过维持细胞膨胀或渗透平衡稳定膜结构，可溶性蛋白的增加对细胞的生命物质及生物膜起到保护作用，提高植物的抗逆性[12]。郭坤元等[13]研究表明，以低浓度外源硒作为引发剂可在一定程度上提高黄精种子可溶性蛋白的含量。本研究发现，以GA3作为引发剂处理后的幼苗可溶性蛋白含量明显高于其他处理(图1)，原因可能是外源GA3能缓解细胞中过氧化作用造成的溶酶体破坏，降低了贮藏物质的降解速度[14]。其次壳聚糖处理也能明显提高可溶性蛋白含量(图1)，一定程度上缓解细胞内蛋白质水解，进而提高抗逆性。

α-淀粉酶与β-淀粉酶是种子贮藏过程中重要的淀粉水解酶，能促进麦芽糖的产生，从而为种子的萌发提供能量[15]。二者对种子萌发过程能量的供给起着重要的调节作用。本试验通过对各试剂中最优处理的淀粉酶活性进行测定发现，GA3处理后α-淀粉酶活性明显高于对照(图2)，β-淀粉酶活性低于12 h水处理但高于其他试剂处理(图3)，说明GA3能诱导植物体内某些水解酶的产生，促进淀粉水解，从而为种子萌发提供能源物质[16]。但是12 h水处理β-淀粉酶显著高于其他处理，这需要后续进行更深入的研究分析。其次是壳聚糖处理后，α-淀粉酶及β-淀粉酶活性较ck均显著上升(p<0.05)。

3.2 种子响应引发处理的机制存在物种间差异

壳聚糖作为种子引发剂有广泛的应用[17]，可以为种子萌发过程中提供外界物质进入种子内部的介质与通道，从而为提高出苗率、抗逆性、增产等打下良好基础。孟显丽等[18]研究表明，壳聚糖对黄豆、红小豆、豇豆、小麦种子萌芽和幼苗均有一定的促生长作用。本试验研究结果与孟显丽结果大致相同，随着壳聚糖浓度的增加，引发效果呈先上升后下降的趋势，1.0%壳聚糖溶液明显提高自然老化甜菜种子活力及相关蛋白酶活性，修复膜系统损伤，增强幼苗抗逆性，减少老化对种子造成的损伤。

GA3具有解除休眠、促进种子萌发的作用，能促进植物茎、叶的生长[19]，微量GA3作为引发剂有提高种子活力的作用[20]。丁忆然等[21]研究表明，适宜浓度的GA3溶液对人工老化的小麦种子活力及抗逆性有一定的修复作用。本研究结果与其结果大致相同，不同浓度的GA3溶液，对老化甜菜种子引发效果也不同。与ck相比，可溶性蛋白含量与淀粉酶的含量在所有处理中最高，这可能与GA3能诱导植物体内水解酶产生有关系。相关研究表明GA3对α-淀粉酶有明显的提高作用[22]。

此外，本试验使用的不同植物生长调节剂或化学试剂在其他种类作物上有显著作用[23-28]，用其处理自然老化甜菜种子后，结果不尽相同。表明不同引发剂作用机理以及不同作物种子对引发的响应过程存在差异，还需要进一步深入分析，为引发剂在实践中更加精准应用奠定理论基础。

4 结 论

本试验研究了不同试剂的不同浓度以及不同时间纯水浸种引发处理对自然老化甜菜种子萌发及幼苗生长的影响，探讨了不同处理与老化种子的萌发动态及生理特性的关系，结果表明，引发处理可在一定程度上修复自然老化甜菜种子的种子活力，同时提高其抗逆性。不同试剂对自然老化甜菜种子的提高效果不相同。以下处理为各试剂最优处理：12 h纯水引发、0.6% H2O2、25% PEG-6000、1.0%壳聚糖、1.5% CaCl2、250 mg·L-1GA3、100 mg·L-1AsA。综合种子活力与幼苗生理生化特性能发现，在本试验中1.0%壳聚糖溶液对老化甜菜种子来说，是效果最好的引发剂及引发浓度；其次，250 mg·L-1GA3对于老化甜菜种子活力修复也起到了明显的效果。为甜菜种子加工和生产提供理论依据和实践指导。