慢性缺氧对胶质母细胞瘤DNA修复基因表达的影响及生物信息学分析*

李瑞静，杨威利，延兴学，李纪同，王潇娜，张耀东

(郑州大学附属儿童医院/河南省儿童遗传代谢性疾病重点实验室/河南省儿童神经发育工程研究中心，河南 郑州 450018)

脑胶质细胞瘤是成人中最常见的一种原发性恶性脑肿瘤，尽管中枢神经系统肿瘤非常罕见，却是癌症发病和死亡的重要原因，尤其是在儿童和年轻人癌症死亡中，分别占约30%和20%[1]，其中胶质母细胞瘤(GBM)是恶性程度及病死率最高的脑胶质瘤病理类型，5年生存率不足10%，年发病率在世界范围内不超过3/10万，无明显的区域差异，男性发病率略高于女性[2-3]，是最具侵袭性的亚型，患者的中位生存期约18个月[2]。目前，GBM的标准治疗方案包括手术治疗、结合放疗和化疗[4]，对于GBM患者的治疗策略是在安全范围内最大限度地进行手术切除与放疗、替莫唑胺化疗结合。

由于GBM肿瘤细胞浸润性生长和受肿瘤部位的制约，手术难以完整地切除肿瘤。放化疗无法特异性地识别肿瘤细胞，且容易产生耐药性。研究发现大脑通过脑膜淋巴管与外周免疫系统相连[5]，这一发现使得肿瘤免疫治疗有望成为GBM最具前景的治疗策略，为其治疗提供了新的方案。GBM有丝分裂活性大、微血管增生坏死且对放化疗具有排斥反应。临床上具有预后不良、合并症多、治疗方式单一等特点[6]。在所有实体肿瘤中，高级别胶质瘤的血管化最为明显，新生血管增生与缺氧诱导的坏死已成为GBM的重要特征，这两项特征与预后不良相关。GBM的特征在于广泛的组织缺氧，与周围空气相比，即使是非肿瘤组织也显示出较低的氧气浓度。成年人体组织的生理氧气状况为2%～9%，远低于吸入的空气中的氧气(20.8%)[7]。缺氧在GBM微环境中，塑造癌症干细胞的表型，细胞异质性是该细胞的特征，并导致难以指定有效的治疗方法。胶质瘤干细胞类细胞已被确定为肿瘤细胞的亚群，被认为是导致耐药性的主要原因[8]。组织缺氧在癌细胞生长，新血管形成，浸润，对化疗、放疗的耐受性及在治疗复发后都具有重要作用[9]。对缺氧的适应使得癌症在肿瘤缺氧环境中发展，介导对减少的氧气的适应性反应的主要机制是缺氧诱导因子1(HIF-1)的激活[10]。

缺氧是GBM的攻击行为和抵抗机制的重要原因，GBM是研究癌症中缺氧的重要模型，缺氧诱导转录因子(HIFs)的上调是对缺氧环境的主要适应性细胞反应[11]。本研究通过分析GBM在慢性缺氧条件下DNA修复基因表达及信号通路变化，进一步明确慢性缺氧引起GBM的分子机制，为GBM恶性脑肿瘤的治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1基因表达数据 慢性缺氧培养的人GBM数据(GSE139250)从NCBI基因表达数据库(GEO database)中下载。本研究分析数据包含3组：21%氧气(正常组)、1%氧气和0.1%氧气(缺氧组)，每组包含12个重复芯片。

1.2数据分析方法 使用limma R包对GEO芯片数据进行差异基因表达分析，使用ggplot包绘制火山图，使用pheatmap包对基因表达数据进行热图绘制。通过对差异基因集进行富集分析，可以找到不同条件下的差异基因与哪些生物学功能或通路显著性相关。使用Gene Oncology软件对改变量≥2倍的基因进行生物过程、细胞组成和分子功能分析，使用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路分析软件分析差异基因主要改变通路，并用String与Cytoscape软件进行蛋白互作网络分析。

1.3统计学处理 数据采用独立样本t检验进行差异基因表达分析，其他数据分析采用相应软件默认统计学方法进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1GBM慢性缺氧时DNA修复差异表达基因的分析 为了明确慢性缺氧对GBM细胞DNA修复表达基因的影响，使用limma R包将慢性缺氧的GBM数据(GSE139250)分为正常组(12个样品)和缺氧组(24个样品)两组，进行差异基因表达分析，设置参数P<0.05,foldchange>2(即|log2FC|>1),并使用ggplot包绘制火山图。GSE139250数据库中只有180个基因通过差异筛选，差异基因表达分析结果显示慢性缺氧时GBM有3个基因表达升高，4个基因表达降低(图1)。对DNA修复基因表达数据进行热图绘制(图2)，慢性缺氧时GBM的7个基因有差异表达，其中表皮生长因子受体(EGFR)是表皮生长因子家族成员的受体，研究已证实GBM的发生、发展与EGFR信号通路密切相关。

红色代表上调的基因，蓝色代表下调的基因，黑色为差异不显著的基因。

红色代表基因高表达,绿色表达基因低表达,样本分为两个组：缺氧组和对照组。

2.2DNA修复差异表达基因的分子功能富集分析 为进一步明确DNA修复差异表达基因的主要分子生物学功能，对差异表达基因使用Gene Oncology进行主要的生物过程、细胞组分及分子功能富集分析。结果显示差异表达基因主要参与了对紫外线辐射的反应、对DNA损伤刺激反应的调节、对光刺激的反应、细胞对非生物刺激的反应、细胞对环境刺激的反应、对电离辐射的反应、肽丝氨酸修饰等生物过程。主要的分子功能为蛋白质酪氨酸激酶活性、磷酸酶结合、肌动蛋白丝结合、蛋白质C末端结合、泛素蛋白连接酶和泛素类蛋白连接酶结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性和蛋白质异二聚体活性等。见图3。

图3 慢性缺氧GBM DNA修复差异表达基因的生物过程、细胞组分和分子功能富集分析

2.3差异表达基因的信号通路富集分析 KEGG通路富集以P<0.05作为显著性富集的阈值，从KEGG富集的结果中选取最显著的20个KEGG通路绘制散点图，分析发现差异表达基因主要与P53信号通路、志贺氏菌、胃癌、结直肠癌、癌症中microRNA等通路相关(图4)。蛋白互作分析结果显示，慢性缺氧的GBM DNA修复差异表达蛋白存在两两相互作用(图5)，对差异表达基因蛋白相互作用的可信度分析结果见表1。使用Cytoscape软件对蛋白相互作用进行可视化,使用Centiscape2.2插件分析基因在网络中的degree,使用degree的高低显示基因的node大小，表中PARP1和ATR代表的node degree最大,表示这两个基因相互作用的基因比较多,属于热点基因(表2)。

图4 慢性缺氧GBM DNA差异表达基因KEGG信号通路富集分析

图5 慢性缺氧GBM DNA差异表达基因蛋白的相互作用网络

表1 String数据库中慢性缺氧GBM DNA差异表达基因蛋白互作可信度

表2 慢性缺氧GBM DNA差异表达基因蛋白相互作用网络分析中的node

3 讨 论

GBM是脑恶性肿瘤中病死率最高和最常见的一种，其肿瘤细胞常常呈浸润性生长，其侵袭转移的能力与临床预后密切相关。GBM也被称为多形性GBM，是一种起源于星形胶质细胞快速发展的、致死性的大脑肿瘤。GBM的发生和发展与EGFR信号通路密切相关。EGFR最常见的突变类型EGFRvⅢ在GBM的发生发展中有重要作用。射线照射对人GBM U87细胞侵袭性具有促进作用，Wnt/β-catenin通路激活和侵袭性相关基因表达的增加是其可能机制。上调谷胱甘肽过氧化物酶表达可以促进GBM细胞株的生长、迁移和侵袭[12]。GBM的发生发展是多基因参与的过程，其中IDH1、MGMT和P53在疾病发展过程中发挥了重要作用[13]。异常的表观基因组是GBM的主要危险因素，是最恶性和致命性的人脑肿瘤[14]。DNA修复酶MGMT的甲基化过高，可防止异常甲基化修复，是GBM患者对烷基化剂(包括替莫唑胺)反应的有力预后生物标志物[15]。

GBM大部分表现为PI3K-AKT-mTOR和RAS-MAPK信号通路的激活，因此被认为是GBM中常见的致癌改变[16]。肿瘤基因通路的激活，如受体酪氨酸激酶(RTKs)的激活，是恶性胶质瘤最常见的基因改变之一。在原发性GBM中，57.4%的患者出现EGFR基因的扩增，通常伴随该蛋白的外结构域的激活突变，而在继发性GBM患者中占8%[17]。PDGFRA基因扩增是RTK通路中常见的基因组改变，对儿童GBM和弥漫性桥脑胶质瘤有显著影响[18-19]。在小鼠GBM模型中，内质网未折叠蛋白响应相关蛋白IRE1控制血管生成、侵袭和间充质分化，内质网未折叠蛋白响应相关蛋白PERK可以刺激GBM的增长，但未折叠的蛋白相关响应在神经胶质瘤发生中的直接作用有待证明[20]。格列本脲下调MCT1蛋白表达，可能通过抑制MCT1的表达，削弱氢离子和乳酸的外向转运，使得细胞内的酸化趋势形成[21]。ABL2在GBM组织中表达较正常脑组织高，沉默ABL2表达可能通过调节pY-421cortactin的水平来抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭[22]。

有关研究表明，在基因突变的共同作用下，可能导致了GBM的形成。经过对小鼠基因突变组合分析发现，B2m-Nf1、Mll3-Nf1和Zc3h13-Rb1共同导致GBM。确定了两个基因的突变Pten 和Zc3h13，改变了Rb1基因突变的表达，从而增加了对化疗药物替莫唑胺的抗性[23]。

综上所述，GBM的发生与发展是多基因、多种信号通路参与的复杂生物学过程，基因突变、表观基因组异常等均会引起GBM的形成。本研究通过生物信息学分析显示，慢性缺氧会引起GBM中部分DNA修复相关基因表达异常，导致GBM酪氨酸激酶活性、蛋白质磷酸化和肌动蛋白异常，引起细胞DNA复制等过程中DNA损伤及细胞增殖与凋亡等，靶向DNA复制及蛋白质酪氨酸激酶激活和磷酸化过程等分子及相关信号通路，深入研究慢性缺氧引起GBM的分子机制，寻找抑制GBM迁移和侵袭的靶点，可能是GBM的潜在治疗手段。