角蛋白支架联合TGF-β3基因过表达载体质粒转染的骨髓间充质干细胞对软骨缺损的修复效果

孙永杰 庞伟苹 叶发刚

(1 青岛大学医学部临床医学系，山东 青岛 266003； 2 青岛大学附属医院创伤外科；3 单县中心医院骨三科； 4 青岛大学附属医院崂山院区心内科)

软骨缺损是骨科常见的疾病之一，如果不及时治疗，会导致骨性关节炎(OA)发生和进展，严重影响患者的运动功能和降低生活质量[1-3]。骨髓间充质干细胞(BMSC)是干细胞组织工程中常见的种子细胞，具有来源广泛、无排异反应的特点[4-5]。既往也有应用BMSC移植促进软骨缺损修复的研究，但是因为干细胞具有多分化潜能，转化为软骨细胞的效率较低[6-7]。而转化生长因子-β3(TGF-β3)可以特异性诱导BMSC向软骨细胞分化[8-9]。角蛋白支架系统是组织工程领域较为先进的支架结构，具有组织兼容性好、硬度适合、易分解的特点[10-11]。本研究利用新西兰大白兔构建胫骨侧软骨缺损动物模型，将TGF-β3基因的过表达载体质粒转染BMSC并联合角蛋白支架对软骨缺损部位进行填充，利用苏木精-伊红(HE)染色、番红-固绿染色和免疫组织化学染色等方法检测软骨缺损的修复情况，以期为临床上软骨缺损的治疗提供新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 动物来源

新西兰种大白兔20只购自济南实验动物中心，清洁级实验动物，雄性，年龄为(12.97±1.21)月，合格证书为(SCXK(鲁)2018-1119)。本研究方案通过青岛大学附属医院动物伦理委员会的批准[批准号：CN(鲁)B2020-7845]。

1.2 试剂

DMEM培养基、胰蛋白酶和HE染液均购自北京碧云天科技有限公司，胎牛血清(FBS)购自以色列BI公司，Aggrecan和Ⅱ型胶原蛋白一抗购自英国Abcam生物技术有限公司。

1.3 兔源BMSC的提取和鉴定

大白兔1只，采用含体积分数0.10的水合氯醛(2～3 mL/kg)腹腔注射麻醉后抽取股骨骨髓2～3 mL。然后加入4 mL含体积分数0.20的FBS的DMEM培养基，接种在细胞培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数0.15的CO2细胞培养箱中培养。每3 d更换DMEM培养基一次，待细胞融合率达80%时，进行细胞传代。培养72 h后，倒置光学显微镜下观察原代BMSC和P3代BMSC，对P3代BMSC按照试剂盒说明书要求，采用流式细胞仪检测BMSC表面CD34、CD45、CD90和CD44蛋白的表达水平。

1.4 TGF-β3基因过表达载体质粒构建和转染

TGF-β3基因过表达载体的构建和筛选由上海吉玛生物有限公司完成。TGF-β3基因引物序列为5′-AATTGCCTAAAAGTCCTGCC-3′。将目的基因扩增序列加入线性化表达载体，选取上海吉凯生物技术有限公司提供的hU6-MCS-CMV-EGFP慢病毒载体作为酶切对象，加入过表达载体序列后进行克隆测定，然后进行质粒的抽提，慢病毒包装后转染BMSC，同时将绿色荧光蛋白(GFP)包裹于慢病毒载体质粒中。TGF-β3基因过表达载体质粒通过慢病毒转染BMSC后，利用倒置荧光显微镜分别于荧光下和白光下观察BMSC细胞及其数量，计算慢病毒的转染率，转染率=荧光下细胞数/白光下细胞数×100%。

1.5 盐沥滤法构建角蛋白支架

将10 g/L的角蛋白与500 μm NaCl颗粒充分混合，室温下风干、成形。根据软骨缺损的大小进行修剪和塑形。消毒后备用，再利用透射电子显微镜(TEM)不同视窗观察角蛋白支架形态。

1.6 动物分组与处理

根据处理方式不同将20只新西兰种大白兔分为4组，每组5只。模型组(A组)仅进行膝关节胫骨侧软骨造模手术：将大白兔腹腔注射水合氯醛麻醉后，分别备皮2个后肢膝关节，切开关节腔，暴露胫骨侧软骨；用口腔钻在软骨上制作一3 mm×2 mm×1 mm大小的锥形软骨缺损，生理盐水冲洗后，逐层缝合切口，静脉注射头孢呋辛钠抗感染处理。支架组(B组)大白兔膝关节胫骨侧软骨缺损造模成功后，于软骨缺损处填充角蛋白支架，然后进行缝合和抗感染处理；联合BMSC组(C组)大白兔膝关节胫骨侧软骨缺损造模成功后，于软骨缺损处填充角蛋白支架联合BMSC复合物，然后进行缝合和抗感染处理；联合过表达质粒转染BMSC组(D组)：大白兔膝关节胫骨侧软骨缺损造模成功后，于软骨缺损处填充角蛋白支架联合TGF-β3基因过表达载体转染的BMSC复合物，然后进行缝合和抗感染处理。处理完成后，兔正常饮食，12-12 h明暗交替光照，24 ℃恒温、安静环境中饲养1个月。然后所有兔均以耳缘静脉注射空气方式处死，取后肢软骨缺损部分，以石腊包埋。

1.7 缺损软骨修复情况观察

将石蜡包埋标本切片，严格按照说明书要求进行HE染色后，置于倒置光学显微镜下观察，利用改良O′Driscoll评分系统评估缺损软骨修复情况。将切片标本按照番红-固绿染色说明书要求进行染色后，利用改良Mankin评分系统评估缺损软骨修复情况。切片标本中加入Ⅱ型胶原蛋白一抗4 ℃湿盒避光孵育过夜，PBS溶液冲洗3次；羊抗兔IgG二抗避光孵育30 min，PBS溶液冲洗3次；中性树胶固定，倒置光学显微镜下观察染色的强度。

1.8 统计学分析

2 结 果

2.1 兔源BMSC的培养和细胞表面CD分子的表达水平

原代BMSC呈多角形，贴壁生长，P3代BMSC呈长梭形(图1)，表明细胞由幼稚的原代细胞已成长为成熟的细胞；流式细胞仪检测结果显示，P3代BMSC表面的CD34、CD45、CD90、CD44蛋白表达比率分别约为0.002、0.006、0.720、0.669，表明BMSC培养成功。

2.2 慢病毒的转染率及角蛋白支架形态观察

TGF-β3基因过表达载体质粒通过慢病毒转染BMSC的转染率为(92.11±4.22)%。GFP绿色荧光染色结果显示，慢病毒转染成功的BMSC呈绿色荧光，细胞形态正常，质粒均匀表达于BMSC内；在同一白光下视野观察到BMSC的细胞形态正常，呈梭形，无皱缩变形(图2)。透射电子显微镜观察角蛋白支架形态，15 μm视窗下可见角蛋白纤维条索规则，100 μm和1 mm视窗下可见角蛋白支架表面有大小不一的凹陷(图3)。

2.3 各组兔缺损软骨修复情况

HE染色和番红-固绿染色结果显示，A组可见大面积软骨缺损，基底部可见软骨下骨增生活跃；B组缺损处有少部分软骨组织长入，但仍可见较大缺损；C组缺损处愈合较好，多为纤维愈合；D组软骨缺损基本愈合，愈合处多为软骨组织(图4)。A组、B组、C组和D组O′Driscoll评分分别为18.45±2.65、14.09±1.59、13.02±1.33、10.02±0.59，各组间比较差异有显著性(F=9.342，P<0.05)，其中D组O′Driscoll评分明显低于其他组(q=2.018～2.498，P<0.05)；而B组和C组O′Driscoll评分比较差异无显著性(P>0.05)。

A组、B组、C组和D组的Mankin评分分别为0.21±0.02、0.59±0.07、0.56±0.08、1.22±0.13，各组间比较差异具有显著性(F=8.549，P<0.05)；其中D组Mankin评分明显高于其他组(q=2.237～3.457，P<0.05)；而B组和C组比较差异无显著性(P>0.05)。见图5。

免疫组织化学染色结果显示，A组和B组缺损软骨处可见少量Ⅱ型胶原蛋白表达，C组和D组缺损软骨处均可见Ⅱ型胶原蛋白表达，C组多为纤维愈合，D组棕色染色更深，多为软骨组织愈合。见图6。

A：原代BMSC，B：P3代BMSC，200倍

A：荧光下视野，B：白光下视野，GFP绿色荧光染色，400倍

A～C分别为15、100 μm和1 mm视窗下结果

A～D分别为A～D组，200倍

A～D分别为A～D组，200倍

A～D分别为A～D组，200倍

3 讨 论

软骨缺损在关节外科中比较常见，多由直接或间接外力引起，导致关节内产生游离体，造成关节卡顿[12-13]。严重时可加剧关节磨损，可以造成OA的发生[14-15]。目前尚无有效的治疗方案，主要通过关节镜取出游离体、利用支具进行保护以及口服硫酸氨基葡萄糖等药物进行治疗，但临床效果并不是非常理想[16-17]。即使手术后可以获得短期的疼痛缓解，但从远期效果来看，OA的发生率增高[18]。所以，对于软骨缺损修复的研究十分必要。

干细胞是组织工程领域常见的种子细胞，因其具有的多分化潜能可以在一定条件下向骨细胞和软骨细胞分化[19-20]。既往围绕干细胞分化的研究较多，徐青镭等[21]对兔源BMSC进行分离培养后，利用碱性成纤维细胞生长因子和TGF进行细胞层面的诱导分化，结果发现，碱性成纤维细胞生长因子和TGF可以促进BMSC向软骨细胞分化，从而促进半月板组织的修复。杨昆等[22]通过构建WNT2B过表达载体，以慢病毒转染BMSC，研究结果发现WNT2B过表达的载体可以诱导BMSC向软骨细胞分化。本研究通过分离并培养兔源BMSC，P3代BMSC表面的CD90蛋白和CD44蛋白表达量高，而CD34和CD45的表达量低，符合BMSC的特点，说明培养的细胞确为BMSC。然后以慢病毒携带TGF-β3基因过表达载体转染BMSC，结果转染率较高，说明TGF-β3基因过表达载体可以稳定表达于BMSC。将兔按照不同的方法进行处理，免疫组化染色结果显示，D组软骨缺损处Ⅱ型胶原蛋白染色明显高于其他组，说明TGF-β3基因过表达载体转染的BMSC促进了成软骨分化。

对于组织工程中支架的选择，往往大多关注支架的组织兼容性、细胞吸附性以及是否易降解、是否可引起免疫反应等方面[23-24]。目前可供选择的有水凝胶支架、角蛋白支架、丝蛋白支架等[25-26]。既往研究中，角蛋白支架大多用于神经再生组织工程，孙泉等[27]利用盐析法构建角蛋白支架，将神经干细胞接种于角蛋白支架上，结果显示，角蛋白可以促进神经干细胞向神经细胞的分化。部分研究表明，角蛋白可以作为骨组织工程和软骨组织工程的支架[28-29]。本研究利用角蛋白作为支架，联合BMSC，观察其促软骨分化情况，结果显示，兔软骨缺损处有少部分软骨组织长入，但仍可见有缺损存在；C组软骨缺损愈合较好，但多为纤维愈合；D组软骨缺损愈合完全，组织严密，修复处多为软骨组织。同时本研究还利用改良O′Driscoll评分对软骨缺损修复情况进行评估，结果显示，D组评分明显低于其他组；Mankin评分结果显示，D组评分明显高于其他组，说明经过TGF-β3基因过表达载体转染的BMSC与角蛋白支架联合处理后软骨缺损修复组织多为软骨组织，缺损软骨愈合较好。

综上所述，本研究将TGF-β3基因过表达载体通过慢病毒转染BMSC，联合角蛋白支架制备复合物，填充于新西兰大白兔的膝关节软骨缺损处，探究其对软骨缺损的修复作用，结果表明，联合过表达质粒转染的BMSC干预后，软骨缺损处基本愈合，组织严密，多为软骨组织，说明角蛋白支架联合TGF-β3基因过表达载体质粒转染的BMSC复合物可以有效促进软骨缺损的修复，为临床上软骨缺损患者的治疗提供了数据参考。但关于角蛋白支架联合TGF-β3基因过表达载体质粒转染BMSC修复软骨缺损的具体机制，还有待进一步研究。