核糖体合成调控因子1对乳腺癌细胞阿霉素抗性的影响

郑文祥 王军 杨茜 周娜 侯琳

(青岛大学基础医学院，山东 青岛 266071 1 生物化学与分子生物学系； 2 病理系)

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内位居女性癌症死亡原因的首位[1-2]。随着综合疗法的发展，乳腺癌患者的生存率有了显著提高。阿霉素是广泛用于乳腺癌治疗的蒽环类药物[3]，目前脂质体[4-5]、新型纳米材料[6]等与阿霉素的联合应用在临床显示了良好的治疗效果。尽管阿霉素对乳腺癌具有显著的疗效，但由于其耐药性[7]，导致一些患者的预后仍然较差。耐药还可导致乳腺癌的复发和转移概率增加，从而影响患者的预后[8]。因此，如何逆转肿瘤细胞对化疗药物的耐受性成为近年来的研究热点之一。

肿瘤细胞的耐药机制非常复杂[9]，其中一些与肿瘤发生发展密切相关的蛋白异常表达是一个重要原因[10]。核糖体合成调控因子1(RRS1)主要定位于细胞核仁和内质网，参与调节核糖体蛋白、RNA生物合成[11]，并且与细胞的衰老[12]、周期调控[13]等密切相关。近年来研究表明，在多种不同的肿瘤中都观察到RRS1的表达明显升高。进一步研究发现，沉默RRS1的表达可明显促进乳腺癌细胞的凋亡[14]。因此RRS1可作为治疗乳腺癌的一个潜在的新靶标，但目前尚未发现关于RRS1与化疗药耐药性之间关系的研究报道。因此本实验拟探讨沉默RRS1表达是否会增强乳腺癌耐药细胞对于阿霉素的敏感性，为乳腺癌耐药研究提供数据参考。

1 材料和方法

1.1 材料来源

人乳腺癌MCF-7细胞系由我院医学研究中心赠送；人耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR细胞系购自湖南丰晖生物科技有限公司；DMEM、RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒、胰蛋白酶消化液及青链霉素混合液、BCA蛋白质定量试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；细胞周期检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；RRS1单克隆抗体购自英国Abcam公司；慢病毒转染载体和转染试剂盒购于上海吉凯基因医学科技股份有限公司。

1.2 细胞培养及处理

将MCF-7细胞培养于含体积分数0.10的胎牛血清和含10 g/L青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基中；MCF-7/ADR细胞培养于含5 mg/L阿霉素、含体积分数0.10胎牛血清和含10 g/L青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中。所有细胞均置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的细胞培养箱内常规培养，待细胞生长至对数期进行后续实验。

1.3 实验方法

1.3.1Western blot方法检测RRS1在MCF-7与MCF-7/ADR细胞中的表达 取对数生长期的乳腺癌MCF-7细胞与耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR细胞分别进行培养，当细胞融合度约达90%时，弃掉培养基，分别用PBS洗1次，采用RIPA裂解法提取总蛋白，裂解缓冲液配制比例为PMSF∶RIPA=1∶100，采用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度。以SDS-PAGE电泳分离蛋白，目的蛋白转移到PVDF膜上后，室温下以体积分数0.05脱脂奶粉封膜2 h，然后在4 ℃下以一抗(1∶1 000)孵育过夜。TBST洗膜3次后，二抗(1∶1 000)室温下孵育1 h，TBST洗膜3次，使用ECL试剂盒检测蛋白的表达。实验重复3次，结果取均值。

1.3.2慢病毒的构建及各组细胞的转染 慢病毒构建委托上海吉凯基因医学科技股份有限公司，实验分为携带有shRRS1慢病毒感染组(实验组)和空载体慢病毒转染组(对照组)两组。根据预实验，得出实验组和对照组的MOI值均为30，最适作用时间为9 h。取对数生长期的MCF-7/ADR细胞用胰酶消化后进行计数，以每孔6×105个细胞接种于6孔板中，待细胞融合度约达60%时换为无血清培养基，加入病毒及感染增强液，作用9 h换为完全培养基继续培养。48 h后用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的强弱，即代表病毒的转染效率的高低。选取GFP表达率70%以上稳定转染的细胞进行后续实验。

1.3.3Western blot方法检测MCF-7/ADR细胞RRS1蛋白的表达量 提取稳定转染的实验组和对照组细胞总蛋白，以Western blot方法检测两组细胞中RRS1蛋白的表达量。

1.3.4CCK8法检测阿霉素对MCF-7/ADR细胞的抑制水平 取稳定转染的实验组和对照组细胞，以3 000个/孔的密度接种于96孔板中，后分别加入0.01、0.10、0.20、0.30、0.50、0.80、1.00 mg/L的阿霉素37 ℃培养48 h，每个浓度设3个复孔。每孔细胞经PBS洗涤2次后，加入10 μL CCK8，正常培养条件下孵育3 h，用酶标仪测量波长450 nm处的吸光度值，计算IC50值。

1.3.5流式细胞术检测细胞内阿霉素累积量 取稳定转染的实验组和对照组的细胞分别与阿霉素(5 mg/L)共同孵育2 h后用胰酶消化，离心重悬于冰冷的PBS中，由于阿霉素自带红色荧光，可通过流式细胞仪检测红色荧光强弱，以红色荧光强弱代表细胞内阿霉素的相对累积量。

1.3.6平板克隆实验检测细胞的增殖水平 制备稳定转染的实验组和对照组单细胞悬液，将两组细胞以3 000个/孔的密度接种于6孔板中，每组3个复孔。置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱内常规培养，约10～14 d出现肉眼可见的集落后终止培养。弃旧培养基加PBS后洗3次。每孔加体积分数0.04多聚甲醛溶液2 mL固定细胞30 min；结晶紫染色30 min，流水缓慢冲洗，室温自然晾干；将6孔板倒置并叠加一张带有网格的透明胶片，低倍镜下观察集落形成情况，计数大于10个细胞的克隆数。

1.3.7流式细胞术检测细胞凋亡情况 制备稳定转染的实验组和对照组单细胞悬液并进行细胞计数，取5×105～1×106个细胞重悬于500～1 000 μL 1×Binding Buffer中，2 000 r/min离心5 min；弃上清液，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬细胞后，加入5 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，室温避光孵育15～20 min；加入200～300 μL 1×Binding Buf-fer，上机检测前5 min加入5 μL PI，混匀后将细胞悬液用300目筛网过滤，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.4 统计学分析

使用GraphPad Prism 6.0软件对数据进行统计学分析处理，计量资料以均数±标准差进行表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MCF-7和MCF-7/ADR细胞中RRS1表达量比较

Western blot实验结果显示，MCF-7和MCF-7/ADR细胞中RRS1蛋白相对表达量分别为0.79±0.03和1.27±0.02，两者比较差异均具有显著意义(t=13.05，P<0.05)。

2.2 两组细胞中RRS1蛋白表达量的比较

对照组和实验组细胞中RRS1蛋白相对表达量分别为1.38±0.07、0.33±0.04，组间比较差异具有显著性(t=12.71，P<0.05)。

2.3 阿霉素对两组MCF-7/ADR细胞抑制能力的比较

实验组和对照组阿霉素对MCF-7/ADR细胞IC50值分别为(0.74±0.12)、(12.37±0.07)mg/L，两组比较差异有显著性(t=2.87，P<0.05)。

2.4 两组细胞中阿霉素累积量的比较

对照组和实验组细胞中阿霉素的累积量分别为(5.84±0.11)%、(24.46±1.10)%，两组比较差异有显著性(t=16.92，P<0.05)。

2.5 两组的细胞增殖能力比较

对照组和实验组的克隆形成数分别为430.0±5.8、177.3±1.5，两组比较差异均具有显著意义(t=42.44，P<0.05)。

2.6 两组的细胞凋亡率比较

对照组和实验组的细胞凋亡率分别为1.26±0.03、65.34±0.52，两组比较差异具有显著意义(t=122.40，P<0.05)。见图1。

图1 两组细胞凋亡率比较

3 讨 论

目前，乳腺癌已经超过肺癌成为全球发病率最高的恶性肿瘤[1]，而且发病率呈逐年上升的趋势。化疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分，化疗药物对乳腺癌有明显的疗效，可以明显改善乳腺癌患者的预后[15-16]。阿霉素作为一种蒽环类广谱化疗药物，较早应用于乳腺癌的治疗，在乳腺癌术后辅助治疗、新辅助治疗和转移或复发后的再次治疗中被普遍采用[17]。单独应用阿霉素或阿霉素与其他抗肿瘤药物联合应用对早、晚期乳腺癌均疗效显著。但部分患者在接受阿霉素化疗一段时间后，会出现继发性耐药；还有部分未接受过阿霉素化疗的患者对该药物的反应性很低，会出现原发性耐药，但具体的耐药机制尚不清楚[18-19]。因此揭示乳腺癌对阿霉素耐药的机制，寻找耐药相关分子或基因，对提高阿霉素疗效具有重要意义。

目前研究发现，化疗耐药性的产生与某些基因在肿瘤细胞内的异常表达密切相关[10]。RRS1作为RRS的一种，主要参与核糖体的生物合成过程[11]。近年来研究发现，RRS1的表达水平与宫颈癌的细胞周期有关[20]。在视网膜母细胞瘤组织和细胞中RRS1均表达升高，促进了视网膜母细胞瘤细胞的增殖和侵袭。WU等[21]研究发现，干扰RRS1可抑制大肠癌细胞周期的G2/M进程，对新生血管生成也有抑制作用，从而抑制了肿瘤细胞的增殖和侵袭。目前已经证实RRS1在乳腺癌组织中的表达水平高于周围的非癌组织，且RRS1的高表达水平与患者淋巴结转移及不良临床预后有关。体内外研究均显示，沉默RRS1基因能抑制乳腺癌细胞的增殖[14]，并显著促进乳腺癌细胞的凋亡。以上研究均证实RRS1表达升高会促进肿瘤的发生发展，但RRS1的表达水平变化是否与乳腺癌细胞对阿霉素抗性的产生有关尚不清楚，在乳腺癌细胞阿霉素抗性中的作用机制也不是很明确。

本研究首先比较人乳腺癌MCF-7细胞和人耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR细胞中RRS1的表达水平，显示与MCF-7细胞相比，RRS1在MCF-7/ADR细胞中呈高表达，说明RRS1在耐阿霉素的乳腺癌细胞中表达水平较高。为进一步探讨相关的作用机制，本研究通过慢病毒载体介导的shRNA沉默MCF-7/ADR细胞中RRS1的表达，检测阿霉素对细胞IC50值的变化，结果显示在MCF-7/ADR细胞中沉默RRS1后可使阿霉素对细胞的IC50值明显降低，因此提示RRS1的表达升高与阿霉素抗性的产生有关。流式细胞术及平板克隆方法检测显示，沉默RRS1后，可显著促进MCF-7/ADR细胞凋亡，抑制MCF-7/ADR细胞的增殖能力，并使细胞内阿霉素累积量明显升高，表明RRS1表达升高可能会导致乳腺癌细胞对阿霉素产生抗性，而沉默RRS1表达后可降低乳腺癌细胞对阿霉素的抗性。

综上所述，RRS1在耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADR细胞中高表达，沉默RRS1表达可显著抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡，降低MCF-7/ADR细胞对阿霉素的抗性，RRS1在乳腺癌细胞阿霉素抗性的产生过程中发挥了重要作用，有望成为乳腺癌治疗新的分子靶点。