贵州狐臭柴不同部位提取物及其抗氧化活性

杨宁线 阳 娇 王艳秋 张明生

(1. 贵阳护理职业学院药学系，贵州 贵阳 550081; 2. 贵州大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

过量自由基的产生是人体疾病发生的重要原因，抗氧化性物质可通过抑制氧自由基反应的发生来保护生物大分子如脂质、蛋白质及DNA[1-2]等，从而防止许多疾病的发生。虽然有许多人工合成的抗氧化物质，但因安全性和潜在的毒性等不足，合成的抗氧化剂使用范围受到了较多限制[3]。因此，近年来从植物中寻找安全性更高的天然抗氧化物质，引起了许多研究者的关注[4-5]。研究[6-8]表明，一些药用植物中的多酚、黄酮等化合物具有显著的抗菌、抗衰老、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等生物活性。

狐臭柴(PremnapuberulaPamb.)系马鞭草科豆腐柴属植物，其叶片含蛋白质、果胶、过氧化物酶等多种营养成分，可用于食品、化工、医药等行业[9-11]。目前关于该植物的研究多集中在植株的生长发育，神仙豆腐的制作及营养保健功能，果胶提取工艺的优化及不同干燥方式对结构的影响等方面[12-15]。仅有李永琴[16]报道过狐臭柴的总酚和总黄酮含量，然而对黄酮类成分的种类、各成分含量及抗氧化活性等的研究尚未见报道。文章拟研究贵州地区狐臭柴总酚和总黄酮成分、含量及抗氧化活性，分析各成分与抗氧化能力的相关性，以期为食品天然抗氧化剂的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

狐臭柴：贵州大学农旅研学实验示范基地；

柚皮素、芹菜素、芦丁、槲皮素标品：北京索莱宝科技有限公司；

没食子酸、维生素C标品：上海源叶生物科技有限公司；

DPPH、ABTS：分析醇，生工生物工程股份有限公司；

甲醇、磷酸等：色谱纯，天津市富宇精细化工有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：Agilent 1260型，美国安捷伦科技有限公司；

酶标仪：SpectraMax Versamax型，美国美谷分子仪器有限公司；

紫外分光光度计：UV-6000SE型，上海元析仪器有限公司；

超声波细胞破碎仪：1030HT型，南京舜玛仪器设备有限公司；

电热鼓风干燥箱：101-3A型，天津市泰斯特仪器有限公司；

冷冻离心机：H4-20KR型，湖南可成仪器设备有限公司；

粉碎机：JY-100型，浙江省永康市象珠松青五金厂；

分析天平：BSM-220.4型，上海电子科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 样品采集于2020年7月28日，随机选取5株植物，选取生长状况良好的根(主根)、茎(主枝条的茎段)、叶(顶端向下第3枝的前3对叶片)3个部位，清洗后分别于50 ℃烘干至恒重，粉碎过60目筛，密封，4 ℃贮藏备用。

1.2.2 总酚提取

(1) 提取工艺：参照文献[16]并修改。料液比(m样品∶V提取剂)1∶25 (g/mL)、超声时间60 min、提取温度60 ℃，4 200 r/min离心10 min，上清液定容至50 mL，测定720 nm处吸光度。

(2) 总酚含量测定：参照文献[17]，标准曲线方程为y=0.009 1x+0.003 2，R2=0.999 1。

1.2.3 总黄酮的提取

(1) 提取工艺：参照文献[18]。

(2) 总黄酮含量测定：参照文献[19]，标准曲线方程为y=0.011 9x-0.001 3，R2=0.999 0。

1.2.4 黄酮类化学成分及含量测定

(1) 对照品溶液的制备：参照文献[19]并修改。用甲醇溶液配制质量浓度分别为1 080 μg/mL的芦丁、1 120 μg/mL的柚皮素、1 550 μg/mL的槲皮素、1 030 μg/mL的芹菜素标准品溶液，等比稀释为梯度质量浓度的对照品溶液。

(2) 供试品溶液的制备：参照文献[17]，充分摇匀后微孔滤膜过滤。

(3) 色谱条件：参照文献[9]并修改。色谱柱为capcell pak C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇溶液为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B进行梯度洗脱：0～23 min，50% A；23～28 min，100% A；28～50 min，100% A；体积流量0.9 mL/min，槲皮素检测波长为256，372 nm，芦丁检测波长为256，356 nm，芹菜素检测波长为268，340 nm，柚皮素检测波长为290 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

(4) 标准曲线：参照文献[16]并修改。芹菜素的线性方程为y=89.041x-4.762，r=0.999 0，芦丁的线性方程为y=15.236x+39.302，r=0.999 1，未检测出柚皮素和槲皮素两种黄酮类成分。

1.2.5 抗氧化试验

(1) DPPH自由基清除能力：参照文献[20]。

(2) ABTS+自由基清除能力：参照文献[21]。

1.2.6 数据分析 所有试验重复3次，结果用平均数±标准差表示，采用Origin 2018软件作图，SPSS 23.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 含量分析

2.1.1 总酚及总黄酮含量 由表1可知，狐臭柴根、茎、叶中总酚及总黄酮含量差异显著(P<0.05)，其中叶片总酚含量最高为30.05 mg/g，约为茎、根中的3倍和9倍；总黄酮和总酚含量的变化趋势相同，依次为叶>茎>根，其中叶中总黄酮含量为(6.54±0.17) mg/g，约为茎中的10倍，这是因为黄酮类是植物的次生代谢产物，常作为主要成分在高等植物的根、茎、叶普遍存在[22]。这与李永琴等[18]的报道基本一致，说明狐臭柴总酚和总黄酮含量较高，且叶中的总酚和总黄酮含量显著高于茎的。

表1 狐臭柴不同部位总酚及总黄酮含量†

2.1.2 黄酮类成分 狐臭柴根、茎、叶不同部位中黄酮成分的高效液相色谱图见图1，各成分含量见表2。由表2可知，狐臭柴中芦丁和芹菜素含量分布依次为茎>根>叶，根、茎、叶中芦丁质量分数分别为(25.68±0.21)%、(74.42±0.32)%，(2.28±0.03)%，芹菜素质量分数分别为(0.24±0.02)%，(0.35±0.02)%，(0.14±0.01)%，各组织器官间均有显著性差异(P<0.05)，可能与植物根、茎中次生代谢产物丰富有关[22]，但是未检测出槲皮素和柚皮素，可能是这两种成分含量太低引起的，与范超敏等[23]的研究结果一致。

图1 狐臭柴根、茎、叶黄酮成分的高效液相图谱

表2 狐臭柴不同部位黄酮类化学成分含量†

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1 OH自由基清除能力 由图2可知，狐臭柴中总黄酮的抗氧化能力依次为叶>茎>根，当样品质量浓度为0.1 mg/mL时，狐臭柴叶的DPPH自由基清除率为82.5%。这是因为DPPH自由基在517 nm处有比较稳定的特征吸收峰，常用于评价抗氧化成分的自由基清除能力[24]。

图2 狐臭柴不同部位对DPPH自由基的清除率

总黄酮的IC50值与抗氧化活性呈反比，IC50值越小，样品的抗氧化能力越强[25]。由图3可知，维生素C与根、茎、叶的IC50值相比具有显著性差异，狐臭柴根、茎、叶的IC50值分别为(23.38±0.14)，(8.21±0.09)，(1.13±0.06) mg/mL，维生素C的IC50为(0.16±0.04) mg/mL，是因为抗氧化活性与黄酮类成分有较大关系，而狐臭柴具有强的抗氧化活性。谢娟平等[26]研究发现豆腐柴叶的抗氧化能力约为商陆叶的16倍，且同种植物的叶比根的抗氧化性能力强。综上，狐臭柴叶的抗氧化能力最强，且其半数清除率高于大蒜乙酸乙酯萃取物的[27]。

图3 狐臭柴不同部位与阳性对照维生素C的IC50值

2.2.2 清除ABTS+自由基能力 由图4可知，狐臭柴对ABTS+自由基的清除能力为叶>茎>根。黄酮类成分结构中存在多个酚羟基，能提供大量电子，可以将多种自由基转化为稳定的结构并进一步中断反应，从而起到抗氧化作用[4]。因此，狐臭柴叶的抗氧化活性最强，且该部位总酚及总黄酮的含量最高，推测狐臭柴的抗氧化活性可能与总酚及总黄酮的含量有关。

图4 狐臭柴不同部位对ABTS+自由基的清除作用

2.3 主成分分析

运用SPSS 23.0软件以总酚、总黄酮、芦丁、芹菜素含量、DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力6个指标为变量，对狐臭柴不同组织进行主成分分析，结果见表 3。由表3可知，主成分1个的特征值>1，且其方差贡献率为86.46%，基本涵盖了6个指标的86%以上的数据信息。

表3 各成分的特征值、方差及累计贡献率

由表4可知，第1主成分为总黄酮含量，ABTS+自由基清除能力与总酚含量有较大的得分系数，这与抗氧化活性结果一致，因此可以将总黄酮含量、ABTS+自由基清除能力和总酚含量作为评价狐臭柴根、茎、叶抗氧化活性评价的主要指标。

表4 第1主成分因子得分系数

3 结论

试验表明，药食兼用植物狐臭柴根、茎、叶总酚含量分别为3.26，9.58，30.05 mg/g，总黄酮含量分别为0.22，0.58，6.54 mg/g，芦丁和芹菜素含量依次为茎>根>叶。各组织的抗氧化活性均随样品质量浓度的升高而增强，且与总酚、总黄酮含量呈正相关，其中叶的抗氧化活性最强，且叶片产量大，加工方便。综上，狐臭柴具有良好的抗氧化活性。试验仅对该植物根、茎、叶的总酚和总黄酮的抗氧化活性进行了初步探究，尚未比较各成分与抗氧化能力之间的相关性，后续应重点关注其他黄酮类成分及含量，并测定黄酮类成分的体内抗氧化活性，为狐臭柴天然抗氧化剂的开发提供更充分的理论依据。