山葡萄花青素对慢性酒精中毒小鼠认知障碍的改善作用

刘 贺 贺 阳 谷家栋 文连奎

(吉林农业大学食品科学与工程学院，吉林 长春 130118)

酒精是一种嗜神经类脂性中枢神经抑制剂，能够通过机体血脑屏障与脑组织卵磷脂结合产生神经细胞毒性作用[1]。长期过量饮酒会使人依赖成瘾导致慢性酒精中毒(Chronic alcoholism，CA)，增加机体氧化应激反应，造成大脑神经元结构被破坏甚至凋亡，导致中枢胆碱能系统功能紊乱和神经信号传导异常，从而引发认知功能障碍[2-3]。据报道[4]，CA发病率逐年增长且发病人群趋于年轻化。目前主要采取强制戒酒和临床药物改善CA导致的认知障碍，但强制戒酒具有极强的个体差异性且临床治疗副作用大，因此寻求天然安全的功能因子改善CA导致的认知障碍具有重大意义[5]。花青素是天然类黄酮多酚类化合物，对阿尔兹海默症以及东莨菪碱诱导认知障碍具有改善作用[6-8]，但对CA导致认知障碍的改善作用未见报道。山葡萄作为花青素良好来源，物质资源丰富但利用率低[9]。

试验拟以山葡萄花青素为试材，采用Morris水迷宫和跳台试验评价山葡萄花青素对CA小鼠认知功能的影响，探讨山葡萄花青素对CA小鼠氧化应激反应及胆碱能系统的改善作用，旨在为山葡萄花青素保健食品以及临床药物深度开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

试验用无特定病原体动物雄性ICR小鼠：许可证号SCXK(京)2019-0008，体重约25～30 g，饲养于吉林农业大学小动物实验中心(批号NO.1103221911001900)屏障环境中，北京华阜康生物科技有限公司；

山葡萄花青素：参照He等[10]的方法自制；

56%vol二锅头酒：食品级，北京红星股份有限公司；

二氧化硅：分析纯，北京化工厂；

4%多聚甲醛溶液、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、乙酰胆碱(ACh)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、蛋白定量测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要仪器设备

电子分析天平：CPA-125型，德国Sartorius公司；

离心机：KL04-A型，美国Agilent公司；

Morris水迷宫视频跟踪分析系统：WMT-100型，成都泰盟科技有限公司；

跳台仪：DTT-2型，上海欣曼科教有限公司；

酶标仪：HBS-1096B型，美国Molecular Devices公司；

电动玻璃匀浆机：DY89-Ⅱ型，宁波新芝生物科技有限公司；

超低温保存箱：MDF-382E型，日本SANYO电器公司；

奥林巴斯生物显微镜：BX53型，北京瑞科中仪科技有限公司；

轮转式切片机：RM2016型，德国徕卡公司。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组 将40只小鼠饲养在(23±2) ℃，相对湿度(55±10)%，明暗交替各12 h，自由摄食和进水的屏障环境中，适应7 d后随机分为4组：空白组(CK，等体积生理盐水)、模型组[NC，30%乙醇，10 mL/(kg·d)]、山葡萄花青素低剂量组[LD，25 mg/(kg·d)]和山葡萄花青素高剂量组[HD，50 mg/(kg·d)]。

1.2.2 模型建立 参照蒋曦等[11-12]的方法修改如下：造模共30 d并分为两个阶段：CK灌胃生理盐水，其他组动物每天灌胃30%乙醇溶液，连续灌胃15 d；从第16天开始，灌胃乙醇溶液1 h后开始灌胃相应剂量的山葡萄花青素，连续灌胃15 d。第31天开始Morris水迷宫试验(MWM)，第37天开始跳台试验。试验期间每3 d记录小鼠体重。

1.2.3 Morris水迷宫试验 参照卢聪[13]的方法修改如下：水池内置圆形透明安全平台(直径80 mm，高150 mm)。试验开始时将水池水面分成4个象限，将安全平台放置于第Ⅳ象限中央，向水池中加水至水面高出安全平台1 cm，调整水温为(25.0±0.5) ℃，加入300 g二氧化钛，混匀成乳白色液体，隐藏透明安全平台所在位置。小鼠给药1 h后进行水迷宫试验。

(1) 定位巡航阶段(5 d)：除第Ⅳ象限外，小鼠从其他3个象限边缘中点位置进入水池，每只小鼠每天训练3次，每次训练时间120 s。记录逃避潜伏期(即小鼠从入水到找到安全平台所需时间。若小鼠未找到安全平台，则需将其引导至安全平台并停留10 s，记录其逃避潜伏期为120 s)、小鼠总游程。

(2) 空间探索阶段(1 d)：试验开始撤掉水中安全平台，第Ⅱ象限为小鼠入池位置，入水时间固定120 s。记录小鼠首次登台时间、穿台次数、第Ⅳ象限停留时间、第Ⅳ象限路程百分比及小鼠游泳轨迹。

1.2.4 跳台试验 参照王方[14]的方法修改如下：小鼠置于跳台仪中自由探索30 s，将小鼠放在橡胶圆台上，小鼠跳下圆台给予电流刺激，重复2～3次，24 h后开始试验。

(1) 获得阶段(1 d)：将小鼠置于橡胶圆台上，电栅栏通电(24 V，3 s)。记录300 s内小鼠跳台潜伏期(即第一次跳下平台的时间，若300 s内未跳下平台，则记录其潜伏期为300 s)和错误次数(即300 s内跳下平台次数)。

(2) 巩固阶段(1 d)：将小鼠置于橡胶圆台，电栅栏通电。记录300 s内小鼠潜伏期和错误次数。

1.2.5 生化指标测定 水迷宫和跳台试验结束，各组小鼠禁食不断水12 h后进行眼球取血，静止30 min，4 ℃、3 500 r/min 离心10 min，取上清液；取脑组织在冰上分离海马体，并与冷生理盐水按m海马体∶m生理盐水为1∶9混合匀浆，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，取上清液。测定血清和海马体上清液T-SOD、MDA、CAT、GSH、GSH-Px、Ach及AChE含量。

电视画面中的字幕发布了首相的指示：“你们中的许多人都安全地聚集在学校礼堂和社区中心里。我们要求你们待在原地，这样你们能得到处理。假如你们待在家中，请待在原地；我们会找到你。”

1.2.6 海马体组织病理学观察 用生理盐水将小鼠海马体洗净，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，用乙醇脱去组织中水分，用透明剂二甲苯替换出组织中的乙醇，再经石蜡包埋、切片、染色、脱蜡、脱水、封片后，于显微镜下进行观察。

1.2.7 数据统计与分析 试验结果均以平均值±标准差表示，使用SPSS 24.0软件进行统计分析，采用单因素ANOVA分析比较组间差异，P<0.05为差异显著，P<0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 山葡萄花青素对小鼠Morris水迷宫试验的影响

2.1.1 定位巡航阶段 由表1可知，训练5 d后，CK、NC、HD潜伏期分别缩短了48.50%，25.91%，41.38%，小鼠逃避潜伏期虽有所缩短，但与CK比较NC明显延长，且从试验第1天开始差异极显著(P<0.01)，表明CA能够显著延长小鼠逃避潜伏期，造成空间学习及记忆保持能力损伤。花青素干预后，训练第2天开始逃避潜伏期显著缩短(P<0.05或P<0.01)，这是由于山葡萄花青素增强了小鼠对于水中安全平台所在位置的记忆能力，使小鼠在短时间内找到并登陆安全平台。

表1 山葡萄花青素对小鼠逃避潜伏期的影响†

由表2可知，各组小鼠经过训练后总游程均有所缩短，CK、NC、HD小鼠总游程分别缩短了35.82%，21.41%，28.53%。与CK相比NC在第1天总游程开始差异显著(P<0.05或P<0.01)，NC小鼠在水迷宫中缓慢沿着边缘循环式游动，基本无空间探索行为，CA造成小鼠机体运动能力和认知能力失调；与NC相比HD在第3～5天总游程极显著缩短(P<0.01)，说明花青素可提高小鼠机体运动能力，期间产生平台探索行为，提高认知能力。

表2 山葡萄花青素对小鼠总游程的影响†

2.1.2 空间探索阶段 由表3可知，与CK相比，NC首次登台时间极显著延长(P<0.01)，穿台次数、第Ⅳ象限停留时间和路程百分比均极显著减少(P<0.01)，表明CA导致小鼠不能准确定位到安全平台所在区域以及具体位置，产生空间记忆能力障碍。与NC相比花青素干预后首次登台时间显著缩短了27.00%(P<0.01)，穿台次数显著增加至(3.00±2.55)次(P<0.05)，第Ⅳ象限停留时间及路程百分比分别增加了21.13%和24.24%(P<0.01)，这是因为山葡萄花青素代谢产物进入到脑中增强了海马体对外界刺激信号接受及传导能力，增加了小鼠对安全平台的位置记忆能力和位置探索行为，并提高了其空间记忆能力。

表3 山葡萄花青素对小鼠空间探索阶段试验指标的影响†

由图1可知，CK小鼠游泳轨迹大多呈直线式且能够产生安全平台定位探索行为，在短暂搜索后即可定位并登陆平台。NC和LD游泳轨迹呈边缘循环轨迹，没有明确目标。HD轨迹呈趋向式，有探索安全平台位置行为，穿台次数及平台所在象限游泳轨迹增加。MWM试验表明，CA能够降低小鼠的空间记忆及学习能力，与王蓉等[5，15-16]的结果吻合。山葡萄花青素能够提高CA导致的认知功能损伤，与原花青素[1]、大豆异黄酮[17]等类黄酮多酚物质对于认知障碍改善作用相似。

图1 山葡萄花青素对小鼠游泳轨迹的影响

2.2 山葡萄花青素对小鼠跳台试验的影响

由表4可知，与CK相比，NC跳台潜伏期极显著缩短(P<0.01)，跳台错误次数极显著增加(P<0.01)，表明CA对小鼠空间学习和被动回避记忆能力产生损伤作用。与NC相比，HD在获得阶段和巩固阶段的跳台潜伏期分别延长了26.39%和26.61%(P<0.01)，错误次数分别减少至(3.38±0.92)，(2.63±0.74)次(P<0.05或P<0.01)，花青素干预后小鼠延长安全平台停留时间，且跳下平台受到强直刺激后能够立即跳回平台。由于海马体CA1区对于强直刺激反应明显，花青素能够改善该区域神经元受损，增强机体对于该种刺激记忆及反射进而跳回安全平台。跳台试验表明CA会造成小鼠认知障碍且山葡萄花青素对此有显著改善作用，与石哲[12]的结果不同，可能是干预物质不同，在机体代谢中生成的产物不同导致其改善作用存在差异，其具体机制有待深入研究。

表4 山葡萄花青素对小鼠跳台试验的影响†

2.3 山葡萄花青素对小鼠抗氧化应激的影响

机体内源性抗氧化系统中，SOD/GSH-Px/CAT共同发挥抵御氧化应激损伤作用[18]。由表5可知，与CK相比NC小鼠血清和海马体中T-SOD、CAT、GSH、GSH-Px水平均极显著降低(P<0.01)，MDA含量极显著增加(P<0.01)，这是由于CA导致血液中酒精含量增加，酒精代谢产物乙醛可通过血脑屏障进入神经元产生大量活性氧，抑制抗氧化酶活性并降低抗氧化蛋白含量，攻击血脑中多不饱和脂肪酸引起脂质过氧化形成过氧化脂质，造成核酸、蛋白质等生物大分子物质损伤，与吴伟青[5]的结果一致。与NC相比HD小鼠血清和海马体中T-SOD分别增加了8.62%和6.80%，CAT分别增加了25.34%和17.39%，GSH分别增加了28.14%和3.57%，GSH-Px分别增加了16.14%和25.85%，MDA分别降低了21.24%和27.70%，这是由于山葡萄花青素进入血脑屏障，发挥抗氧化应激作用，抑制质脂过氧化，修复神经细胞损伤，平衡细胞间神经兴奋传导稳态，进一步加强学习记忆能力，与荣爽[19]的结果相近。

试验发现T-SOD差异不显著但活性增加明显，CAT和GSH分别在海马体和血清中具有显著性，可能是由于花青素在机体不同位置的代谢产物不同，具体原因仍需进一步研究。Cui等[20]研究发现，花青素抑制脑缺血模型小鼠脑组织中MDA的增加和SOD的减少，能够激活核因子E2相关因子2(Nrf2)和HO-1蛋白表达，通过Nrf-2/HO-1途径减轻氧化应激损伤保护神经元；Ali等[21]研究发现，阿尔兹海默症模型中花青素能够调节磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶/Akt/糖原合成酶激酶3β(p-PI3K/Akt/GSK3β)途径，进而刺激Nrf-2/HO-1内源性抗氧化系统，降低氧化应激损伤，改善认知功能障碍。花青素调节PI3K/Akt/GSK3β途径激活内源性抗氧化剂Nrf2/HO-1途径，可能是其抗氧化应激的可能通路，可以此作为切入点探究关于花青素改善CA导致认知障碍的通路。

表5 山葡萄花青素对小鼠抗氧化应激指标的影响†

2.4 山葡萄花青素对小鼠胆碱能系统指标的影响

研究[5]表明，CA引起机体大脑相关中枢神经系统的损伤，通过引发氧化应激反应紊乱中枢胆碱能系统平衡，引起神经信息传递功能障碍，最终导致机体出现多种神经行为改变。ACh是关于认知功能的重要神经递质，在学习记忆中起重要作用，AChE作为胆碱能神经元生理活性特异性标记物的蛋白质酶，在神经元乙酰胆碱的稳态中发挥重要作用。由图2可知，与CK相比NC中AChE极显著升高(P<0.01)，ACh含量极显著降低(P<0.01)，AChE活性升高会过量分解ACh，引发中枢胆碱能系统失衡，无法作用于突触后膜发挥信号传导作用，导致兴奋传导及记忆存储信号混乱，甚至导致神经元细胞凋亡。与NC相比HD能显著抑制AChE活性(P<0.05)，显著增加ACh含量(P<0.05)，花青素干预后能够有效改善海马体中胆碱能系统损伤，增强ACh与突触后膜特异性受体的结合，增强突触可塑性及突触后效应，使神经元突触间的信息传递效率增强，促进记忆形成。

与CK组比较，*为P<0.05，**为P<0.01；与NC组比较，#为P<0.05，##为P<0.01

2.5 山葡萄花青素对小鼠海马体组织的影响

海马体是机体中神经元可塑性区域，在学习记忆认知功能过程中发挥重要作用。酒精造成学习记忆损伤的一个重要原因是其对海马体神经细胞的毒性作用[22]。由图3可知，CK海马体CA1区神经细胞层次分明，细胞结构完整形态清晰可见。NC海马体CA1区神经细胞排列分散层次混乱，细胞数目减少，部分细胞变性、坏死溶解呈空泡且难以辨别。这与石哲等[12，23]的结果相似，表明CA会导致海马体CA1区神经细胞损伤。与NC组比较HD海马体CA1区神经细胞排列较整齐，结构相对正常，细胞数目增多，表明山葡萄花青素可以改善CA导致的小鼠海马神经元受损。

图3 山葡萄花青素小鼠海马体CA1区神经元的影响

3 结论

试验表明，慢性酒精中毒会导致小鼠认知功能障碍；酒精导致机体氧化应激水平增加，引发中枢神经系统中胆碱能稳态失衡，这是慢性酒精中毒导致认知障碍的可能机制之一。山葡萄花青素对此具有改善作用，可显著提高慢性酒精中毒小鼠学习记忆能力，提高血脑中抗氧化应激水平，调节海马体胆碱能神经系统稳态，恢复受损神经元，改善认知障碍。后续将深入分析山葡萄花青素抗氧化应激作用相关靶点，并进行PI3K/Akt/GSK3β-Nrf2/HO-1途径机制研究。