健脾补肾活血方对大鼠骨髓源内皮祖细胞生物学功能的影响

尚官红，王晓丽，刘向哲

(1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.南阳张仲景医院，河南 南阳 473000；3.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000)

缺血性脑血管疾病(Ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是临床常见的由脑血管病变导致的神经系统性疾病，严重威胁人类健康[1-2]。现代医学认为，血管内皮细胞(Endothelial cells，ECs)损伤是脑血管疾病发生的重要机制之一。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)主要来源于骨髓，是ECs的前体细胞，可形成ECs并促进血管的形成[3-4]。提高EPCs的增殖及迁移能力，促进脑缺血部位的血管再生,是目前的研究重点。

健脾补肾活血方主要由黄芪、党参、白术、桑寄生、杜仲、牛膝、丹参、肉苁蓉、川芎、石菖蒲、甘草组成，具有健脾补肾、活血通络作用。方中丹参、黄芪能显著增加EPCs细胞数量，促进内皮修复[5-8]。课题组前期研究结果表明，健脾补肾活血方能改善缺血/再灌注大鼠的神经功能评分，缩小脑梗死的面积，其作用机制可能与增加外周血中EPCs水平有关[9]。本实验以分离出的大鼠骨髓源内皮祖细胞(Bone marrow-derived endothelial progenitor cells，BMEPCs)为研究对象，探讨健脾补肾活血方对大鼠BMEPCs增殖、迁移和黏附能力的影响，为健脾补肾活血方的临床应用提供理论和实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：健康清洁级SD雄性大鼠5只，4～5周龄，平均体重(100±10)g，生产许可证号[SCXK(辽)2015-0001]，购自辽宁长生生物科技有限公司。大鼠饲养温度控制在(22±1)℃、湿度45%～55%、光照节律12 h∶12 h,自由进食饮水。

1.1.2 主要仪器：CO2培养箱(型号HF-90，上海力申公司)、超净工作台(型号SW-CJ-2FD，苏州净化公司)、酶标仪(型号ELX-800，美国Biotek公司)、倒置相差显微镜(型号IX53，日本Olympus公司)、显微镜拍照系统(型号DP73，日本Olympus公司)、超速冷冻离心机(型号H-2050R，湖南湘仪公司)。

1.1.3 主要试剂：健脾补肾活血方冻干粉(河南省仲景方药健康衰老产业工程研究中心实验室)、大鼠淋巴细胞分离液(批号P8630，北京索莱宝科技有限公司)、乙酰化低密度脂蛋白(Dil labeled acetylated low-density lipoprotein,Dil-Ac-LDL)(批号MP6013，上海懋康生物科技有限公司)、荆豆凝集素-1(FITC-labeled ulex europaeus agglutinin 1,FITC-UEA-1)(批号MP6308，上海懋康生物科技有限公司)、EGM-2MV培养基(批号CC-3202，美国Lonza公司)、胎牛血清(批号SH30084.03，美国Hyclone公司)、胰酶(批号T4799，美国Sigma公司)、MTT(批号WLA021，沈阳万类生物科技有限公司)、Transwell小室(批号3422，美国Corning公司)、多聚甲醛(批号P6148，美国Sigma公司)、结晶紫(批号0528，美国Amresco公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠骨髓单核细胞(Bone marrow mononuclear cells,BMMNCs)的分离[10]：将5只SD大鼠常规麻醉消毒，无菌条件下取出四肢长骨，无菌PBS冲洗，收集骨髓液。将大鼠淋巴细胞分离液注入离心管中，沿管壁缓慢滴入骨髓液，2000 r/min、室温、离心20 min，中间的白色云雾层即为单核细胞，无菌PBS清洗2次，以含有10%胎牛血清的EGM-2MV培养基重悬细胞，调整细胞密度至1×106个/ml备用。

1.2.2 大鼠BMEPCs的诱导及培养[11]：取密度为1×106个/ml的细胞悬液，接种到人血浆纤维连接素包被的T25培养瓶中，加入含10%胎牛血清的EGM-2MV培养基，于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养。培养2周左右，原代细胞逐渐融合至80%，调整细胞密度，以1∶2或1∶3进行传代。

1.2.3 细胞活力检测：取1滴细胞悬液与1滴0.2 %台盼蓝染液混合，滴在血球计数板上，统计细胞总数并计算细胞活力。细胞活力=活细胞数/总细胞数×100%。

1.2.4 BMEPCs的鉴定：EPCs具有吞噬Dil标记的Dil-Ac-LDL和结合FITC标记的FITC-UEA-Ⅰ的功能。BMEPCs培养14 d后进行Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色以鉴定分离出的BMEPCs。调整BMEPCs细胞密度，加入10 μg/ml的Dil-Ac-LDL，37 ℃、5% CO2培养箱中避光孵育4 h，无菌PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS再次漂洗后，加入80 μg/ml的FITC-UEA-1，37 ℃、5% CO2培养箱中避光孵育1 h后，荧光显微镜下观察BMEPCs吞噬Dil-Ac-LDL及结合FITC-UEA-1的情况。

1.2.5 细胞分组及给药：细胞传代培养14 d后，取生长状态良好的BMEPCs，以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，正常培养24 h。细胞饥饿处理后，设空白对照组、健脾补肾活血方低剂量组(0.35g/ml)、健脾补肾活血方中剂量组(0.65 g/ml)、健脾补肾活血方高剂量组(1.0 g/ml)，每组5个复孔。

1.2.6 MTT法检测BMEPCs增殖：分别予四组细胞给药继续培养24 h后加入MTT染色液(20 μl/孔)。孵育4 h后，弃去上清，加入150 μl的DMSO溶解细胞中形成的紫色结晶。避光反应10 min，酶标仪测定波长570 nm处OD值。

1.2.7 Transwell检测BMEPCs迁移能力：取生长状态良好的BMEPCs，用无血清的培养基重悬细胞，调整细胞密度至2×104个/50 μl，注入50 μl细胞悬液于Transwell小室上层，将50 ng/ml的VEGF加入到各组含药培养基中，并注入Transwell下层。在37 ℃、5% CO2环境中继续培养24 h，计算细胞迁移数。

1.2.8 BMEPCs黏附能力检测：调整BMEPCs密度至1×104个/孔，铺在包被人血浆纤维连接素的96孔培养板上，37 ℃培养1 h。用PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定后，1%结晶紫染色，显微镜下拍照并计算梭形细胞数量。

2 结 果

2.1 BMEPCs活力检测 结果显示着色细胞数为(4.00±1.00)个，未着色细胞数为(55.67±7.64)个，细胞总数为(59.67±6.66)个，BMEPCs活力为93.3 %，满足后续实验要求。

2.2 Dil-Ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色鉴定BMEPCs 荧光显微镜观察结果显示，BMEPCs摄取Dil-Ac-LDL后，细胞胞浆呈红色，BMEPCs吞噬FITC-UEA-1后，细胞胞浆呈绿色，同时显示双荧光阳性呈橙色的细胞为BMEPCs(图1)。

A：Dil-Ac-LDL；B：FITC-UEA-1；C：Merge

2.3 各组BMEPCs增殖情况比较 见表1。与空白对照组比较，健脾补肾活血方低、中、高剂量组细胞的吸光度值均升高，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。健脾补肾活血方低剂量组、健脾补肾活血方中剂量组细胞的吸光度值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。健脾补肾活血方高剂量组细胞的吸光度值高于健脾补肾活血方低剂量组、健脾补肾活血方中剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表1 各组BMEPCs增殖情况比较

2.4 各组BMEPCs迁移能力比较 见表2(图2)。健脾补肾活血方低、中、高剂量组细胞迁移个数均多于空白对照组，且呈剂量依赖性，差异有统计学意义(P<0.05)。健脾补肾活血方低剂量组、健脾补肾活血方中剂量组细胞迁移个数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。健脾补肾活血方高剂量组细胞的迁移个数高于健脾补肾活血方低剂量组、健脾补肾活血方中剂量组，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表2 各组BMEPCs迁移能力比较(个)

A：空白对照组；B：健脾补肾活血方低剂量组；C：健脾补肾活血方中剂量组；D：健脾补肾活血方高剂量组

2.5 各组BMEPCs黏附能力比较 见表3(图3)。健脾补肾活血方低、中、高剂量组细胞黏附数均高于空白对照组，且呈剂量依赖性，差异具有统计学意义(P<0.05)。健脾补肾活血方低剂量组、健脾补肾活血方中剂量组细胞黏附数比较，差异无统计学意义(P>0.05)。健脾补肾活血方高剂量组细胞黏附数高于健脾补肾活血方低剂量组、健脾补肾活血方中剂量组，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表3 各组BMEPCs黏附能力比较(个 )

A：空白对照组；B：健脾补肾活血方低剂量组；C：健脾补肾活血方中剂量组；D：健脾补肾活血方高剂量组

3 讨 论

研究发现，当脑组织损伤或缺氧时，外周血中EPCs增加，并迁移归巢至脑组织损伤处，形成ECs以促进血管的生成。由此可见，恢复EPCs的增殖迁移能力，促进血管新生对治疗ICVD具有重要临床意义。EPCs来源于骨髓，具有分化ECs的特点，与中医 “肾主骨生髓” 理论一致[12]。诸多研究表明，补肾益气中药可增加EPCs数量，提高其增殖、迁移及动员能力，从而促进脑缺血区血管修复及再生[13]。补阳还五汤能增加外周血EPCs的增殖、迁移及黏附能力[14]。另有研究发现，补肾活血汤通过激活MMP-9信号通路，使大鼠BMEPCs进入外周血循环，促进其迁移至受损血管内皮处，修复受损血管内皮细胞[15]。赵瑞成等[16]发现，柔肝通络汤通过增加脑缺血大鼠EPCs的数量，促进大鼠脑缺血后的神经功能恢复。综上可知，采用中医药调控EPCs细胞增殖与分化在中医理论上具有一定的可行性。

健脾补肾活血方，具有养气补血、健脾补胃、滋肝补肾的功效[17]。方中党参、白术取四君子汤意，健脾益气；桑寄生、杜仲、牛膝、肉苁蓉补益肝肾，使元气旺盛，脑髓得充；丹参、川芎活血化瘀，与补气药配伍相辅相成；少佐石菖蒲开窍化痰，甘草调和诸药。现代药理研究表明，补肾活血方能促进内源性干细胞的增殖和分化，促进内皮细胞的修复[18]。研究发现黄芪提取物可以提高大鼠EPCs的生物活性，促使其发生黏附和迁移，促进血管新生[19]。丹参的水溶性有效成分可通过增加EPCs数量，促进内皮修复[20]。课题组前期临床研究表明，健脾补肾活血方能够改善脑梗死患者临床症状和体征，提高患者日常活动能力，临床效果较好。由此可见，该方在治疗缺血性血管疾病方面具有较好的临床效果，但其是否能增强EPCs细胞的增殖动员能力尚待研究。鉴于此，本研究通过密度梯度法获取大鼠骨髓单核细胞，并将其诱导生成BMEPCs，体外研究健脾补肾活血方对BMEPCs生物学功能的影响。结果显示，健脾补肾活血方能显著提高BMEPCs增殖、迁移及黏附能力，其影响BMEPCs生物学功能的具体作用机制有待进一步研究。