非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b变化及其临床意义*

葛海燕，匡 霞，周瑞君

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是我国居民特别是老年群体的常见疾病[1，2]。近年来研究发现，普通人群NAFLD发病率约为20%～30%，而T2DM人群中NAFLD发病率可达60%～80%[3，4]。NAFLD患者进展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和肝纤维化还可导致肝硬化和肝细胞癌。NAFLD与T2DM 之间存在复杂的病理学相互作用，值得引起重视[5，6]。探讨NAFLD和T2DM相关标志物对于早期诊疗和治疗药物的开发具有重要的意义。研究发现，微小RNA(micro RNA，miRNA)作为一种短序列小分子，广泛参与NAFLD和T2DM的疾病发生、发展过程，但在NAFLD合并T2DM患者，它们的表达谱改变研究还较少，且存在一定的争议。miRNA分子用于NAFLD合并T2DM患者的临床诊断、病情和疗效评估及预后判断的价值还有待阐明[7，8]。本研究检测了NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b水平变化，以判断其临床意义，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2018年12月～2020年6月我院收治的T2DM患者46例，男性19例，女性27例；年龄39～65岁，平均年龄为(55.9±6.7)岁；NAFLD合并T2DM患者50例(轻度19例、中度17例和重度14例)，男性25例，女性25例；年龄28～67岁，平均年龄为(46.1±6.5)岁。NAFLD诊断符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版)》[9]，无过量饮酒(或饮酒量折合乙醇男性<40 g/d，女性<20 g/d)。T2DM诊断符合《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[10]，空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L。排除标准：存在全身炎症性疾病、自身免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎或恶性肿瘤者；近2个月内有服用降糖药物史；妊娠期或哺乳期妇女；合并心、脑、肾等脏器功能严重不全者。患者签署知情同意书，本研究经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 外周血miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA检测 无菌抽取外周静脉血3 mL，离心，提取总RNA(日本TAKARA公司)，将RNA逆转录为cDNA，将样品保存于-80℃冰箱。采用实时荧光定量RT-PCR法扩增miR-17、miR-20a和miR-20b目标片段，扩增反应体系为20μL，反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 28 s，35个循环完成后，72℃ 10 min。以β-action为内参基因，在反应结束后，以2-ΔΔct法得出3指标的相对水平。引物由南京擎科生物公司合成，使用美国罗氏公司生产的Cobas Lightcycle480z荧光定量PCR仪。

1.3 血生化指标检测 使用日本奥林巴斯公司生产的AU2700型全自动生化分析仪检测。

2 结果

2.1 两组BMI和血脂指标比较 NAFLD合并T2DM患者BMI、血清TG、TC和LDL-C水平显著高于T2DM患者(P<0.05)，而血清HDL-C水平显著低于T2DM患者(P<0.05，表1)。

表1 两组BMI和血脂指标比较

2.2 两组血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平比较 NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平显著高于T2DM患者(P<0.05，表2)。

表2 两组血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平比较

2.3 不同严重程度NAFLD患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平比较 重度组血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平显著高于中度组或轻度组(P<0.05)，中度组血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平显著高于轻度组(P<0.05，表3)。

表3 不同程度NAFLD患者血清miRNA水平比较

2.4 NAFLD合并T2DM的多因素Logistic回归分析 结果显示，BMI、LDL-C、miR-17、miR-20a和miR-20b是NAFLD合并T2DM的独立危险因素(P<0.05，表4)。

表4 NAFLD合并T2DM的多因素Logistic回归分析

2.5 血清 miR-17、miR-20a、miR-20b诊断严重NAFLD的效能分析 经ROC分析显示，血清miR-17、miR-20a、miR-20b诊断严重NAFLD的AUC分别为0.75、0.74、0.70(P<0.05，表5，图1)。

表5 各指标诊断严重NAFLD的效能

图1 血清miRNA诊断严重NAFLD的ROC曲线

3 讨论

相关研究发现NAFLD合并T2DM患者糖脂代谢失衡更为严重，全身炎症水平较高，T2DM和NALFLD进展的倾向更为明显，对其机制进行研究对于改善患者生存质量，延长寿命具有重要的意义[11-15]。T2DM患者存在多种合并症，仅依赖社区血糖监测和降糖药物治疗难以避免并发症的发生。NAFLD早期发病较为隐匿，对其确诊依赖于组织病理学检查，目前临床上主要以影像学检查、血清学检查对其进行评估。

miRNA可抵抗核糖核酸酶的降解过程保持相对稳定，因此循环血miRNA水平被报道对于多种疾病具有良好的诊断效能，还可用于多种疾病的病情和治疗反应的评估，并对预后有一定的预测价值，是具有潜力的血液生物标志物[16，17]，但目前研究有关NAFLD患者miRNA谱变化存在一定的争议。采用微阵列技术研究发现，NAFLD合并T2DM患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平显著升高[18]，与本研究结果一致。NAFLD合并T2DM患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平变化的临床意义尚需进一步阐明。本研究比较了不同严重程度的NAFLD患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b mRNA水平的变化，结果显示随着NAFLD严重程度的加重，血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平也不断升高，提示血清miR-17、miR-20a和miR-20b 可能参与了NAFLD患者发生T2DM的过程，还可能影响NAFLD患者的病情进展。

已有T2DM和NAFLD患者血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平变化的研究报道，体外研究发现，miR-17和miR-20a异位表达可以显著抑制肝细胞Pknox1的表达，而miR-17和miR-20a过表达还可导致HepG2和L02细胞胰岛素敏感性显著提高并减少肝脏脂肪变性[19]。miR-17 可通过靶向调控CYP7A1的方式调控脂肪变性过程，降低HepG2细胞miR-17水平可加剧肝脂肪变性程度[20]。此外，miR-17还可靶向调控Tcf7l2上调成脂分化过程，而Tcf7l2作为Wnt通路的关键效应因子，被认为是T2DM发病的关键风险基因。同时，miR-20a过表达导致肝糖原合成增多，并通过靶向p63激活AKT/GSK信号通路，参与糖生成过程，而miR-20b可通过调控CD36表达影响脂质代谢，在甘油三酯的异常积累中发挥关键作用。这些研究表明，上述miRNAs均在调节肝脏内胆固醇和糖脂代谢等能量代谢过程中发挥重要作用。本研究通过Logistic回归分析发现，血清miR-17、miR-20a和miR-20b 水平与BMI和LDL-C均是导致NAFLD合并T2DM的危险因素，结合其它学者研究可知，miR-17、miR-20a、miR-20b 可能通过调控肝脏糖和脂质代谢，在NAFLD患者发生T2DM过程中发挥一定的生物学功能，但其是否依赖于相同或相似的作用机制进行调节尚未明确，值得进一步研究。

本研究经ROC分析显示血清miR-17、miR-20a和miR-20b 对于严重的NAFLD具有一定的评估效能，是具有潜力的生物标志物。虽然临床已报道了较多血清学指标用于NAFLD的临床评估，但单指标往往存在灵敏度高，但特异性低的缺陷，联合更多的指标对于提高诊断效能具有明显的益处。目前，研究已阐明的NAFLD患者发生T2DM的发生机制有氧化应激、内质网应激改变、炎症反应和凋亡等。当出现胰岛素抵抗时，周围组织对胰岛素敏感性下降，葡萄糖利用率降低，导致糖和脂质代谢的综合性紊乱。血清miR-17、miR-20a和miR-20b在NAFLD发病过程中具体作用机制和对肝纤维化评估的作用仍不明确。本研究结果发现NAFLD合并T2DM患者外周血miR-17、miR-20a和miR-20b水平显著上升，它们可能参与了NAFLD并发T2DM的发病过程，并对NAFLD的严重程度具有一定的诊断效能。但由于本研究是单中心研究，纳入病例数少，可能存在选择偏倚等缺陷，所得结论有待后续研究的不断完善和补充。