代谢相关性脂肪性肝病小鼠不同高脂饮食时期血糖水平和肠道菌群变化动态分析*

首第文，周永健，徐豪明，唐文娟，骆庆玲，梅 情，宁 钢，赵 冲，黄红丽，曹创裕，陈慧婷

代谢相关性脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease，MAFLD)是代谢综合征的一部分，与2型糖尿病、胰岛素抵抗和肥胖有关，已经成为一个世界性的健康问题[1, 2]。MAFLD的发病机制仍未完全确定，其中糖代谢紊乱[3]和肠道菌群调节失衡[4]是关键性因素。MAFLD患者存在肠道菌群紊乱，后者也影响胰岛素抵抗和脂质代谢[5]。本研究旨在通过建立高脂饮食诱导的MAFLD小鼠动物模型，分析不同时期其胰岛素耐受情况和血糖水平变化，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物、饲料、试剂和仪器 雄性SPF级C57BL/ 6 小鼠12只，8周龄，体质量(22±1)g，购于广东省医学实验动物中心，饲养在华南理工大学附属第二医院中心实验室动物中心，每日交替进行12 h光照和12 h黑暗，室内相对湿度在(50±5)%，温度在(23±1)℃。基础饲料购于广东省医学实验动物中心，60%高脂饲料购于戴茨公司(美国)，高脂饲料配方主要为：蛋白20% kcal，碳水化合物20% kcal，脂肪60% kcal。本实验遵循实验动物的3R原则，在华南理工大学附属第二医院动物医学伦理委员会监管下完成。血糖仪和血糖检测试纸(罗氏公司，中国)，注射用10%葡萄糖溶液(广东大冢制药有限公司)，重组人胰岛素注射液(通化东宝药业股份有限公司)。DNA提取试剂盒(D3141，广州美基生物科技有限公司)，Nanorop 微量分光光度计(NanoDrop 2000，赛默飞世尔科技，美国)，PCR 相关试剂(TOYOBO，日本)， 琼脂糖凝胶电泳仪(DYY-6C 型，北京六一仪器厂)，凝胶成像系统(Tanon-2500，上海天能科技有限公司)。PCR 仪(ETC811，东胜兴业科学仪器有限公司)， Qubit 3.0(ThermoFischer Scientific，美国)。

1.2 MAFLD模型的制备 给予60% kcal脂肪饮食[6]，分别在高脂饮食0 w、8 w、16 w和24 w时测量体质量，并将小鼠置于代谢笼，收集粪便，将样本立刻放入-80℃冰箱保存，统一行16 sRNA检测；禁食不禁饮16 h，行葡萄糖耐量实验(glucose tolerance test，GTT)，经尾静脉取血，检测空腹血糖[7]；禁食不禁饮4 h，行胰岛素耐受实验(insulin tolerance test，ITT)，即给予小鼠人短效胰岛素0.5 U.kg-1腹腔注射，分别在15 min、30 min、45 min、60 min、90 min和120 min取血，检测血糖浓度，绘制血糖变化曲线，计算曲线下面积(AUC)[7]。

1.3粪便肠道菌群检测 采用D3141试剂盒提取粪便DNA。经琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop 微量分光光度计检测核酸，判断DNA纯度和浓度。扩增16s rDNA的V3-V4目标区域，引物序列如下：上游：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG，下游：3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT。扩增片段长度为466 bp。使用ETC811分析仪进行cDNA扩增反应。使用 ABI Step One Plus Real Time PCR System(Life Technologies，美国) 进行定量。采用 Novaseq 6000的 PE250 模式 pooling 上机测序，广州基迪奥生物科技有限公司提供专业的测序平台和技术支持。α多样性反映特定生态系统内物种多样性情况，通常利用物种丰富度和均匀度两个重要参数来计算。应用Chao 1指数和ACE指数估计样本中运算的分类单位(operational taxonomic unit， OUT)数目，即物种的数目，Chao1指数和ACE指数的数值越大，代表样本中所含物种越多[8]。

2 结果

2.1 四个时期小鼠葡萄糖耐量试验比较 随着高脂喂养时间延长，注射葡萄糖后小鼠血糖水平显著升高(图1)。

2.2 四个时期小鼠胰岛素耐量试验比较 随着高脂喂养时间延长，注射胰岛素后各时间小鼠血糖水平升高(图2)。

图2 不同时期小鼠ITT变化

2.3 不同时期小鼠粪便肠道菌群α多样性比较 随着高脂饮食喂养时间的延长，小鼠ACE指数和chao 1指数大幅升高(P<0.05，表1)。

表1 不同时期MAFLD小鼠肠道菌群α多样性指数比较

2.4 四个时期小鼠粪便肠道菌群变化 在门水平，与0周比，喂养8周、16周和24周时小鼠菌群厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)比率显著升高，而拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)比率显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；在属水平，与0周比，喂养8周小鼠菌群艾克曼菌(Akkermansia)和瘤胃球菌科-UCG-014属(Ruminococcaceae_UCG-014)比率显著降低，喂养16周小鼠菌群艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014属比率显著降低，而红蝽杆菌-UCG_002属(Coriobacteriaceae-UCG-002)比率显著升高(P<0.05)，喂养24周小鼠菌群艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014属比率显著降低，而红蝽杆菌科-UCG_002属和杜氏杆菌比率显著升高(P<0.05，图3)。

图3 不同时期小鼠属水平肠道菌群差异比较(横坐标为时间(周)，纵坐标为细菌含量百分比)

3 讨论

近年来，MAFLD发病率在全世界范围内逐年升高，已成为最常见的慢性肝病和与肝脏相关死亡的重要原因。肠道菌群失衡和糖代谢紊乱在MAFLD发生发展过程中发挥着关键作用。采用高脂饮食建立的MALFD小鼠模型可形成肥胖和胰岛素抵抗等表现[9]，与人类MAFLD发病机制和表现相似。MAFLD的发生发展及其严重程度与编码炎性细菌产物的基因的丰富度有关。肠道微生物群的改变可能参与了MAFLD的发病，并可以作为疾病或严重程度的标志[10]。在动物模型，已有肠道细菌及其产物如何促进脂肪变性、肝炎、纤维化、肝硬化和致癌作用的机制研究[11]。饮食干预介导的代谢性疾病模型在肝病的研究中有重要的作用，但同时饮食也是肠道菌群的重要影响因素，不同的造模时间可能对糖代谢和肠道菌群产生影响。本文通过研究高脂饮食诱导的MAFLD小鼠在不同时期血糖和肠道菌群的改变，为研究和建立高脂饮食MAFLD小鼠模型提供参考。

本研究采用60%kcal脂肪含量饮食[6]建立MAFLD小鼠模型，与人类NAFLD的代谢特征高度相似[11]，出现肥胖、胰岛素抵抗。经过动态监测小鼠血糖水平[7]，为模型建立提供成功依据。经研究发现，随着高脂饮食时间的延长，小鼠空腹血糖大幅升高。在予以葡萄糖溶液注射后，血糖迅速显著升高，且维持较长一段时间高血糖水平，这种现象在24周高脂饮食喂养小鼠最为明显。在注射胰岛素后，高脂饮食喂养小鼠血糖下降缓慢且一直维持在较高水平，24周高脂饮食喂养小鼠血糖达到最高且下降缓慢，可能与胰岛素敏感性降低，出现胰岛素抵抗有关。研究表明MAFLD与胰岛素抵抗、肥胖等代谢综合征有密切的关系。以往有研究显示，胰岛素抵抗会导致MAFLD，而2型糖尿病的重要危险因素就是MAFLD代谢调节能力降低和胰岛素抵抗，随着肝脏对葡萄糖生产的调节作用减弱，2型糖尿病也随之发生[12,13]。体质量、GTT和ITT均可以在一定程度上反映MAFLD小鼠疾病的严重程度，可以作为良好的观察指标。

本研究结果显示，随着小鼠高脂饮食时间的延长，其肠道菌群多样性增加，可能与致病菌的种类和数量增加有关。经研究发现，在肠道菌群结构方面，高脂饮食小鼠肠道厚壁菌门升高，拟杆菌门下降，厚壁菌门/拟杆菌门(F/B)比值上升。既往研究发现肥胖与拟杆菌和厚壁菌门的相对丰度变化相关，与肥胖相关的微生物具有增加从饮食中获取能量的能力，而且这种特性是可以传递的[14]。疣微菌门的显著下降与艾克曼菌属关系密切，后者在高脂饮食前小鼠肠道菌群占比为19%。小鼠接受高脂饮食的时间越长，艾克曼菌占肠道菌群的比例越少。艾克曼菌是粘液层的一种共生细菌，可以利用粘蛋白作为唯一的碳源、氮源和能源。以往有研究表明，艾克曼菌通过调节肝脏脂肪合成和炎症基因表达预防脂肪肝[15]。研究还发现，艾克曼菌在正常人中比前驱糖尿病患者丰度更高，2型糖尿病的潜在标志物可能是疣微菌门[16]。艾克曼菌可以调节葡萄糖代谢和肠道免疫功能，某些食品成分(如多酚)可能会增加肠道中艾克曼菌的含量[17]，增加艾克曼菌可能有助于二甲双胍的治疗糖尿病作用[18]。因此，在高脂饮食动物艾克曼菌显著下降是重要的MAFLD特征，从8周开始出现显著下降，持续保持在低水平，是重要的MAFLD造模指示细菌之一。本研究发现，随高脂饮食时间的延长，发现一些差异细菌显著减少，在MAFLD的发生发展过程中可能起着关键作用。本研究发现随高脂饮食时间延长，红蝽杆菌科-UCG_002属和杜氏杆菌比率逐渐增加，提示上述细菌可能与MAFLD的氧化应激和代谢表型相关[19]，在一定程度上可以反映MAFLD的严重程度。通过检测上述细菌的比率，将可能成为MAFLD无创检查评估手段之一。

综上所述，随着高脂饮食时间延长，MAFLD小鼠血糖水平升高，肠道菌群多样性增加，肠道菌群结构发生变化，表现为艾克曼菌和瘤胃球菌科-UCG-014属显著下降，红蝽杆菌科-UCG_002属和杜氏杆菌增加，提示肠道细菌变化与MAFLD疾病进程相关。本研究对MAFLD小鼠肠道菌群改变进行了动态观察，为建立以肠道菌群为研究核心的MAFLD小鼠模型提供了一定的参考依据，值得进一步研究。