龙牙楤木多糖复合酶法提取工艺优化及抗氧化活性研究

张桂娟 陈继凌 陶荟竹

(1. 黑龙江生态工程职业学院，黑龙江 哈尔滨 150025；2. 精华制药集团股份有限公司，江苏 南通 226000)

龙牙楤木[Araliaelata(Miq.)Seem.]为五加科楤木属多年生落叶小乔木，又名辽东楤木、刺嫩牙，可药食两用，其根皮和树皮多为药用部分，嫩芽被誉为“山菜之王”。龙牙楤木具有补气安神、除湿止痛、活血祛风的功能，临床上常用于治疗神经衰弱、风湿性关节炎、糖尿病、胃病等[1]，主要含皂苷、多糖、黄酮及挥发油等[2-4]成分；其中，多糖类成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射损伤等作用[5-6]。

目前，常见的多糖提取方法有热水浸提法[7]、酸提取法[8]、碱提取法[9]、超声波辅助提取法[10]、微波辅助提取法[11]和酶提取法[12]等，而龙牙楤木多糖的提取方法仅见于热水浸提[13]及超声波辅助提取[14]。近年来，酶提取法具有提取条件温和，可破坏植物细胞壁而加速有效成分释放，缩短提取时间，并可减少干扰物质溶出，因此，被广泛应用于天然植物有效成分的提取[15-17]。其中，纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶为常用酶类，纤维素酶可水解植物细胞壁组成成分纤维素，木瓜蛋白酶对动植物蛋白、多肽、酰胺等有较强的水解能力，有助于糖蛋白复合物的水解而释放更多多糖，提高提取率。由于植物细胞壁组成结构复杂，单一酶破解细胞壁及细胞膜结构较难，易导致成分溶出不完全。试验拟选用纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶提取龙牙楤木多糖，应用响应面法优化其提取工艺，并考察其抗氧化能力，以期为龙牙楤木多糖精深产品加工、资源合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料与试剂

龙牙楤木：采自黑龙江省伊春市，春季新发的嫩芽；

石油醚、乙醚、95%乙醇、无水乙醇、丙酮、浓硫酸、苯酚、葡萄糖、1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH)、硫酸铁、水杨酸、过氧化氢：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；

纤维素酶(1×104U/g)、果胶酶(4.9×103U/g)、木瓜蛋白酶(5×105U/g)：北京奥博星生物技术有限责任公司；

抗坏血酸：分析纯，无锡市亚盛化工有限公司；

纯化水：pH 7.0～7.5，自制。

1.1.2 主要仪器与设备

紫外可见分光光度计：UV-2200型，北京瑞利分析仪器有限公司；

数显恒温振荡器：WHY-2型，常州普天仪器制造有限公司；

旋转蒸发仪：R-501型，河南宇科自动化仪器仪表设备有限公司；

循环水真空泵：SHZ-DⅢ型，上海英化仪器设备有限公司；

电子天平：ESJ200-4型，沈阳龙腾电子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 龙牙楤木预处理 取龙牙楤木嫩芽鲜品于80 ℃烘干24 h，再于60 ℃烘干至恒重，粉碎成粗粉。石油醚超声脱脂1 h，过滤，挥干石油醚，干燥粗粉备用。

1.2.2 多糖提取工艺

干燥龙牙楤木粗粉→复合酶水解→减压浓缩→醇沉→静置过夜→离心得沉淀→有机溶剂洗涤→挥干有机溶剂→龙牙楤木粗多糖

1.2.3 多糖提取率测定 采用苯酚—浓硫酸法[14]。按式(1) 计算多糖提取率。

(1)

式中：

E——多糖提取率，%；

C——供试品多糖质量浓度，μg/mL；

V——供试品溶液定容体积，mL；

D——稀释倍数；

W——龙牙楤木样品质量，g。

1.2.4 单因素试验

(1) 料液比：精密称取一定量龙牙楤木粗粉，按质量分数1.5%分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，用pH 5.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，酶解温度50 ℃，酶解时间60 min，考察料液比[(m龙牙楤木粗粉∶V缓冲液)分别为1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40 (g/mL)]对多糖提取率的影响。

(2) 酶解时间:精密称取一定量龙牙楤木粗粉，按质量分数1.5%分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，用pH 5.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，料液比(m龙牙楤木粗粉∶V缓冲液)1∶25 (g/mL)，酶解温度50 ℃，考察酶解时间(30，60，90，120，150，180 min)对多糖提取率的影响。

(3) 酶解温度：精密称取一定量龙牙楤木粗粉，按质量分数1.5%分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，用pH 5.5的磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，料液比(m龙牙楤木粗粉∶V缓冲液)1∶25 (g/mL)，酶解时间60 min，考察酶解温度(40，45，50，55，60 ℃)对多糖提取率的影响。

(4) 缓冲液pH值：精密称取一定量龙牙楤木粗粉，按质量分数1.5%分别加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，用磷酸氢二钠与柠檬酸缓冲液作为提取溶剂，料液比(m龙牙楤木粗粉∶V缓冲液)1∶25 (g/mL)，酶解温度50 ℃，酶解时间60 min，考察缓冲液pH值(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0)对多糖提取率的影响。

1.2.5 复合酶酶量配比正交试验 精密称取一定量龙牙楤木粗粉，在单因素试验最适料液比、酶解时间、酶解温度、pH值下，以纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量为因素，以龙牙楤木多糖提取率为评价指标，设计L9(33)正交试验，确定3种酶的最佳添加量。

1.2.6 响应面试验 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理[18-19]，以多糖提取率为响应值，以酶解时间、料液比、酶解温度为响应因素，进行三因素三水平响应面分析试验。利用Design Expert 8.0.5b软件进行回归分析，优化提取工艺。

1.2.7 抗氧化能力的测定

(1) DPPH自由基清除能力：根据文献[20-21]并修改。将DPPH自由基溶于无水乙醇，制成0.1 mmol/L试液。精密量取1 mL不同浓度待测样品于试管中，加入3.0 mL DPPH试液，4.0 mL无水乙醇，混匀，避光反应30 min，测定517 nm处吸光度值，以DPPH自由基试液作空白，按式(2)计算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

R——自由基清除率，%；

A0——空白试液吸光度值；

An——样品反应液吸光度值。

(2) 羟自由基清除能力：根据文献[22]并修改。精密量取3 mL不同浓度的龙牙楤木多糖溶液于10 mL容量瓶中，依次精密加入0.1 mol/L硫酸铁溶液、0.1 mol/L水杨酸溶液及0.1 mol/L过氧化氢溶液各2 mL，纯化水定容，37 ℃水浴30 min，测定510 nm处吸光度值，按式(2)计算羟自由基清除率。

1.3 数据处理

利用Design-Expert 8.0.5、Excel软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比 由图1可知，多糖提取率随料液比的增加先短暂降低后升高再下降，当料液比(m龙牙楤木粗粉∶V缓冲液)为1∶30 (g/mL)时，多糖提取率最大。说明随着提取溶剂的增加，可能因不同酶的作用起效快慢不同，其破坏细胞壁及水解糖蛋白释放多糖的功能优势不同[23]，当料液比增加至一定范围时，酶破解细胞壁的能力达到限度值，而未被酶破坏的细胞内外浓度差亦无明显变化，多糖释放量及溶出量稳定[24]。故料液比(m龙牙楤木粗粉∶V缓冲液)以1∶30 (g/mL)为宜。

图1 料液比对多糖提取率的影响

2.1.2 酶解时间 由图2可知，多糖提取率随酶解时间的延长先升高后暂时降低再升高再降低，当酶解时间为150 min时，多糖提取率达最大值。这可能是由于试验选用的为复合酶，而不同酶的起效作用时间及作用强度不同,或复合酶在释放细胞内多糖及其他成分的同时，对部分多糖糖苷键起水解作用[25]。故酶解时间以150 min为宜。

图2 酶解时间对多糖提取率的影响

2.1.3 酶解温度 由图3可知，多糖提取率随酶解温度的升高先增加后降低，当酶解温度为50 ℃时，多糖提取率达最大值，说明复合酶随着酶解温度的升高活力增强，加快多糖的溶出，当酶解温度升高至一定值后，酶活力下降，提取率降低[26]。因此，酶解温度以50 ℃为宜。

图3 酶解温度对多糖提取率的影响

2.1.4 缓冲液pH值 由图4可知，随着pH值的升高，多糖提取率逐渐降低，当pH值为3.5～4.0时，提取率最高，可能是果胶酶在复合酶提取多糖过程中起主导作用，其在偏酸性条件下酶解作用强，亦或是龙牙楤木细胞中含碱性成分综合其溶剂的酸性，使释放的多糖未被酸水解而保留于溶剂中[27]。同时，为简化操作，测得以自制纯化水为溶剂，溶液pH值为5.96时的多糖提取率与pH值

图4 缓冲液pH值对多糖提取率的影响

为4.0时相近，因此，选择以纯化水为提取溶剂。

2.2 复合酶酶量配比正交试验

在单因素试验最适料液比、酶解时间、酶解温度、pH值下，以纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶的添加量为因素，以龙牙楤木多糖提取率为评价指标，设计L9(33)正交试验。正交试验因素水平见表1，正交试验设计与结果见表2。

表1 正交试验因素水平表

表2 复合酶酶量配比正交试验设计与结果

由表2可知，各因素对多糖提取率的影响程度依次为木瓜蛋白酶>果胶酶>纤维素酶。由表3可知，果胶酶添加量与木瓜蛋白酶添加量对多糖提取率影响显著，纤维素酶添加量对多糖提取率的影响不显著，从节约物料成本投入角度综合考虑，最佳复合酶酶量配比为A1B2C1，即纤维素酶添加量1.0%、果胶酶添加量1.5%、木瓜蛋白酶添加量0.5%。

表3 方差分析表†

2.3 响应面试验优化

2.3.1 试验设计与结果 采用Box-Behnken中心组合试验设计方法，根据单因素试验结果，以酶解时间、酶解温度、料液比为相应变量，以多糖提取率为响应值进行响应面优化试验。响应面试验设计因素水平见表4，试验设计与结果见表5。

利用Design-Expert 8.0.5软件对试验数据进行二次多元回归拟合，得二次回归方程：

(3)

表4 Box-Behnken试验设计因素水平表

表5 Box-Behnken试验设计与结果

表6 方差分析表†

2.3.2 响应曲面图及等高线图 由图5～图7可知，酶解时间、酶解温度、料液比对龙牙楤木多糖提取率影响较大，表现为曲面陡峭。酶解时间与酶解温度的交互作用强于酶解温度与料液比的交互作用，而酶解时间与料液比的交互作用最弱。

图5 酶解温度与酶解时间的交互作用对多糖提取率的影响

图6 酶解温度与液料比的交互作用对多糖提取率的影响

图7 酶解时间与液料比的交互作用对多糖提取率的影响

2.3.3 模型验证 由Design-Expert 8.0.5软件得出复合酶法提取龙牙楤木多糖最佳工艺为：酶解温度53.7 ℃，酶解时间160.2 min，料液比(m龙牙楤木粗粉∶V纯化水)1.00∶31.05 (g/mL),此时预测龙牙楤木多糖提取率为10.78%。考虑到实际操作的可行性，将最佳提取工艺调整为：酶解温度54 ℃，酶解时间160 min，料液比(m龙牙楤木粗粉∶V纯化水)1∶31 (g/mL)，此条件下的龙牙楤木多糖提取率为(10.68±0.05)%(n=3)，与预测值接近，且较热水浸提(5.87%)[13]和超声波辅助提取(4.81%)[14]的分别提高了81.94%和122.04%，说明该模型对龙牙楤木多糖提取工艺条件参数优化可靠，具有较好的应用价值。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由图8可知，当多糖质量浓度为0～8 mg/mL时，3种提取方法所得多糖对DPPH自由基均具有一定的清除作用，且随着多糖质量浓度的增加，DPPH自由基清除能力升高。3种提取方法所得多糖清除DPPH自由基的IC50值分别为6.76，4.96，2.00 mg/mL，但三者对DPPH自由基的清除率均低于维生素C。

图8 3种多糖对DPPH自由基清除率的影响

2.4.2 羟基自由基清除能力 由图9可知，当多糖质量浓度为0～10 mg/mL时，热水浸提法、超声辅助提取法、复合酶法所得龙牙楤木多糖对羟基自由基均具有清除作用，且清除率随多糖质量浓度的增加而上升。当多糖质量浓度为8～10 mg/mL时，羟基自由基清除率上升趋势减弱，最大值分别为54.42%，60.13%，70.10%。3种提取方法所得多糖清除羟基自由基的IC50值分别为6.75，5.25，3.05 mg/mL，三者对羟基自由基的清除率低于维生素C。

图9 3种多糖对羟基自由基清除率的影响

3 结论

以龙牙楤木为原料，以纯化水为溶剂，采用复合酶法提取龙牙楤木多糖，对其提取工艺进行优化并分析其抗氧化活性。结果表明，复合酶法提取龙牙楤木多糖的最佳条件为纤维素酶添加量1.0%，果胶酶添加量1.5%，木瓜蛋白酶添加量0.5%，酶解温度54 ℃，酶解时间160 min，料液比(m龙牙楤木粗粉∶V纯化水)1∶31 (g/mL)，此条件下龙牙楤木多糖提取率为(10.68±0.05)%，与预测值接近。抗氧化试验表明，龙牙楤木多糖对DPPH自由基及羟基自由基的IC50值分别为2.00，3.05 mg/mL，且清除作用均随多糖质量浓度的增大而升高，清除率最大值分别为78.10%和70.10%，表明龙牙楤木多糖具有良好的抗氧化活性。后续需研究龙牙楤木多糖的纯化、分离及结构鉴定等。