小脊椎动物骨骼透明标本制作条件的探讨

陈文芳，桂文龙，颜 卫，孟欣欣，钱逸雪，霍英卓，蒋志伟

（江苏农牧科技职业学院，江苏 泰州 225300）

骨骼透明标本的制作过程受多种因素的影响，近年来对动物骨骼透明标本的制作和应用越来越广泛，制作方法也层出不穷，但对其制作过程的条件探讨很少，本试验通过采用茜素红单染色法探讨不同的室温和不同的碱液浓度对小脊椎动物骨骼透明标本制作效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小脊椎动物 实验所用活体小脊椎动物（蛙类、幼鼠、鱼类）均由江苏农牧科技职业学院实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 氢氧化钾、无水乙醇，丙酮（分析纯，浓度为99.7%），丙三醇（分析纯，浓度为99.0%），茜素红，蒸馏水。

1.1.3 器材 解剖器械、烧杯、量筒、胶头滴管、玻璃棒、托盘天平、广口瓶、标本瓶。

1.2 溶液配制 Y1 系列：将无水乙醇和蒸馏水分别按70%、80%、90%、100%的浓度梯度配制。

Y2 系列：将氢氧化钾和蒸馏水分别按1%KOH、2%KOH、3%KOH的浓度配制。

Y3：茜素红0.01 g，KOH 1.0 g，蒸馏水100 mL，混合均匀。

Y4：丙三醇20 mL，KOH 1.0 g，蒸馏水80 mL，混合均匀。

Y5 系列：将丙三醇和蒸馏水分别按50%、75%、100%的浓度梯度配制。

1.3 方法

1.3.1 选材分组 分别在冬、春季和夏季不同室温条件下，选择活体牛蛙（200 g 左右）、出生一周内的幼鼠、15～20 cm 长的鲫鱼和成年观赏金鱼四种小脊椎动物各12只，随机均分成3组，每组4只，按不同的溶液浓度分别操作。

1.3.2 标本预处理 将新鲜完整的活体小动物分别进行预处理。蛙类用金属探针插入活体枕骨大孔，破坏脑脊髓处死，在腹部正中位置切开小口去除内脏，将标本冲洗干净；鱼刮去鳞片，打开腹腔去除内脏，清洗干净；出生一周内的小鼠，用乙醚麻醉后，打开腹腔取出内脏，清洗干净。

1.3.3 固定 将预处理好的标本放入95%酒精中固定，以确保标本的良好形态，鱼标本用线绑在玻璃片上，使它的姿势呈自然状态。液面没过标本，并将标本尽可能伸展，随时观察固定情况，直到标本骨骼稍硬、可随意翻动为止。

1.3.4 脱水 将标本依次浸泡在80%、90%、100%的Y1系列溶液中，每种浓度溶液浸泡3～7 d。

1.3.5 脱脂 根据标本实际情况选择脱脂，将脱水后的标本在丙酮内脱去脂肪，时间为2～4 d，中间换液1次。

1.3.6 透明 把脱水的标本放入Y2 系列溶液中进行初步的腐蚀透明，随时观察透明情况，中间可根据标本情况更换一次腐蚀软化透明液，直到标本呈半透明状态、能隐约看到骨骼时为止。

1.3.7 染色 把初步半透明的标本放入Y3 溶液中浸泡，使茜素红着色于骨骼。在浸泡过程中随时观察着色情况，直到骨骼染成紫红色为止。着色快慢与标本情况有关。

1.3.8 初步脱色 将标本从Y3 溶液中取出放置于Y4 溶液中浸泡，使染色的软组织脱色变成白色，直到骨不变色为止。

1.3.9 深度脱色 将标本从Y4 溶液中依次放置于Y5系列梯度脱色液中，逐步继续脱色，使软组织逐渐变为无色，直到骨组织清晰可见为止。脱色过程中根据脱色液的浑浊程度决定是否更换更高浓度的脱色液。

1.3.10 保存 将脱色好的标本放入纯甘油（丙三醇）中保存。

2 结果

2.1 碱溶液浓度的影响 在标本染色前的处理中，不同的KOH溶液浓度对标本腐蚀软化透明的时间有较大的影响，如表1所示。

表1 不同的KOH浓度对小动物骨骼软化透明效果的影响（室温5～20 ℃）

从表1可以看出，在相同的环境温度下，同一小脊椎动物在不同的KOH 浓度中达到软组织呈半透明状态、隐约看到骨骼的理想效果，在时间上有较大的差距。随着溶液浓度的增加，每种动物软化透明的速度加快。

2.2 环境温度的影响 在标本的处理、染色和脱色过程中，环境温度均对其制作时间有较明显的影响，如图1～图4所示。

图1 不同室温对标本固定时间的影响（d）

图2 不同室温对标本染色时间的影响（d）

图3 不同室温对标本脱色时间的影响（d）

图4 不同室温对标本透明时间的影响（d）

在较低的气温条件下，几种小脊椎动物标本固定、染色、脱色和透明制作环节的时间都比较长，随着室温升高，制作时间均明显缩短。同等条件下体积最大的鲫鱼在不同室温下的制作时间最长，体积最小的金鱼制作时间最短，蛙和仔鼠的制作时间介于鲫鱼和金鱼之间。故正常室温条件下，温度越高标本制作时间越短，体积越大标本制作时间越长。

3 讨论

3.1 试剂选择 本试验在试剂的选择上选用了成本低、对人体伤害小、效果较好的试剂，如在固定环节选用酒精固定液，因为酒精具有使材料硬化和脱脂的双重作用［1］；在染色前选用梯度浓度酒精和丙酮进行脱水脱脂处理［2］；选用既能软化透明软组织又能增加染料渗透力的KOH 碱液［3］；选用对骨骼染色有特异性的茜素红染色剂［4］；透明剂则选用低成本又无毒的甘油［5］。

3.2 材料预处理 在标本的预处理中动物的剥皮与否取决于标本制作时间快慢的选择，本试验为了保持标本的整体轮廓没有做剥皮处理，标本整体效果较好。标本预处理时应注意保持标本的完整性，尤其不要损害骨骼。

3.3 碱液浓度选择 低浓度的碱液提高了组织的通透性，使染色液和甘油的渗透力增强。但在浓度的选择上应根据实际情况，一方面氢氧化钾碱液具有腐蚀作用，随意提高浓度会使标本受到破坏，因此碱液浓度要从低至高逐步增加；另一方面采用较高浓度的氢氧化钾碱液软化，其间必须随时严格观察，以免短时间内腐蚀过度而破坏组织。在软化透明过程中要注意观察不能透明过久，否则肌肉会腐蚀过度，变软甚至离散。

3.4 效果判断方法 选用眼观变化比较明显的环节，如在标本固定环节可以直接观察和触碰其固定效果，在软化透明环节可以观察标本的肌肉膨胀透明程度，在染色环节可以观察骨骼的染色程度，在脱色环节可以观察软组织的脱色情况等。

4 小结

本试验分别在我国东南部的冬、春、夏三个季节自然气候条件下进行，通过对几种小脊椎动物的对比研究，发现气温较高的夏季，骨骼透明标本的制作时间明显较短，染色效果也较好，而冬季每一步操作的时间都延长，染色效果一般。

不同的标本有不同的最佳碱液浓度，1%KOH溶液适用于体积很小、软组织较少的标本，3%KOH 溶液适用于软组织较厚、体积较大的标本，而浓度大于3%的氢氧化钾溶液不适用于组织的软化透明。本试验得出：鲫鱼标本选择3%KOH、金鱼标本选择1%KOH，而仔鼠和蛙标本选择2%KOH较为合适。

动物骨骼透明标本的制作周期、标本质量及观察效果除了受环境温度、动物体质量、碱性试剂浓度等关键因素的影响外，标本最终的染色效果还与固定液浓度和时间、脱水脱脂液浓度等密切相关，同时受动物年龄大小、动物体型大小、环境湿度等因素的直接影响。