响应面法优化硬毛棘豆总黄酮的提取工艺

刘 洋，丁艳霞，岳 鑫，王晓琴

（内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010059）

硬毛棘豆（oxytropishirta bunge）为豆科多年生草本植物，又名毛棘豆[1]，地上部分入蒙药，为“达克沙”正品药材[2]，与多叶棘豆功效相同，能杀“粘”，消热，燥“黄水”，生肌，止血，消肿，通便，用于瘟疫，吐血，咳痰[3]。棘豆属多种植物的民间用药历史悠久，多见于蒙药、藏药以及一些草药典籍收载；国内外学者对其中的20余种药用植物已经进行了深入的研究报道，表明本属的特征性成分为黄酮类、三萜类和生物碱类成分，且已从这个属分离得到了100多个黄酮类成分[4~6]。目前，硬毛棘豆还没有系统的化学成分研究，药理学研究尚空白。课题组前期对硬毛棘豆的植化研究表明其富含黄酮类化合物，本研究首次采用响应面法优化了硬毛棘豆中总黄酮的提取工艺，并测定不同产地硬毛棘豆的总黄酮的方法，以期为硬毛棘豆药效物质基础的研究和进一步开发利用提供参考依据。

1 仪器与材料

AL-204型分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），UV-1280型紫外可见分光光度计（日本岛津）。

实验用的9批药材均为2017-08~2018-08采集于硬毛棘豆的主产地内蒙古赤峰市周边地区；芦丁标准品购买于中国药品生物制品检定所，批号0080-9705；实验用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取干燥至恒重的芦丁标准品5 mg，精密称定，配制成50 μg·mL-1的对照品溶液，贮藏于4℃冰箱备用。

2.2 供试品溶液的制备

取干燥的药材粉末（过80目筛）0.2 g，精密称定，加入70%乙醇25 mL，超声60 min，摇匀并过滤，取续滤液即得。

2.3 吸收波长的确定

吸取对照品溶液3 mL和供试品溶液2 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入1 mL的1%AlCl3甲醇溶液，用甲醇定容，静置15 min。以显色剂为空白，在200~800 nm波长范围内进行全波长扫描，结果显示供试品溶液与对照品溶液在275 nm处均有最大吸收，且干扰较小，故选择275 nm作为测定波长（见图1）。

图1 芦丁对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的吸收波长扫描

2.4 方法学考察

2.4.1标准曲线的绘制 精密量取芦丁对照品溶液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0 mL分别置于10 mL量瓶中，按“2.3”项下的方法显色后，以显色剂为空白，测定吸光度，以吸光度（A）为纵坐标，浓度（μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程Y=0.0446 X+0.015（r=0.9993）。结果表明，芦丁在2.5~15.0 μg·mL-1的浓度范围内与A值呈良好的线性关系。

2.4.2精密度试验取硬毛棘豆药材粉末，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的方法显色后，在275 nm处测定吸光度A，重复6次，结果A分 别 为0.7556、0.7551、0.7555、0.7558、0.7553、0.7550，A值的RSD为0.04%，表明仪器精密度良好。

2.4.3稳定性试验取硬毛棘豆药材粉末，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24 h后显色，在275 nm处测定吸光度A。按“2.4.1”项下计算总黄酮的含量分别为20.89mg·g-1、20.83mg·g-1、20.85mg·g-1、21.00mg·g-1、21.05mg·g-1、21.09 mg·g-1，RSD为0.52%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4重复性试验 取硬毛棘豆药材粉末，按“2.2”项下的方法平行制备供试品溶液6份，分别精密量取1 mL供试品溶液于10 mL量瓶中，显色后，在275 nm处测定吸光度A，按“2.4.1”项下计算总黄酮的平均含量为20.49 mg·g-1，RSD为0.35%，表明本实验采用的方法重复性良好。

2.4.5加样回收率试验 取已知含量的硬毛棘豆药材粉末约0.1 g，精密称定，平行称定9份，分别精密加入相当于药材中总黄酮含量的80 %，100 %，120%倍量的对照品溶液，平行测定3份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，显色后，以显色剂为空白，在275 nm处测定吸光度A。计算加样回收率及RSD，表明该方法准确度良好（见表1）。

表1 加样回收率试验结果

2.5 总黄酮提取工艺单因素实验

2.5.1提取方法的考察 取药材粉末约0.2 g，精密称定4份（n=2），两份分别置于50 mL圆底烧瓶中，用25 mL 70%乙醇浸泡30min，加热回流提取30 min，冷却，补足减失重量，摇匀并过滤。另两份分别置于50 mL具塞锥形瓶中，用25 mL 70%乙醇浸泡30min，超声（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却，补足减失重量，摇匀并过滤。计算总黄酮含量分别为17.42mg·g-1、16.98 mg·g-1。由结果可知，两种提取方法测得含量相差不大，考虑操作简便快捷，确定提取方法为超声提取。

2.5.2提取溶剂的考察 取药材粉末约0.2 g，精密称定18份（n=2）于50 mL具塞锥形瓶中，分别以水、30%、50%、70%、100%的甲醇以及30%、50%、70%、100%的乙醇各25 mL为提取溶剂，超声提取30min，结果可知70%乙醇提取的总黄酮含量最高。

2.5.3超声时间的筛选 取药材粉末约0.2 g，精密称定12份（n=2），分别超声提取20min、30min、40min、50min、60min、90 min，其余方法相同。结果显示超声提取时间选择60 min为宜。

2.5.4取样量的筛选分别取药材粉末约0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5 g，精密称定10份（n=2），超声提取60 min，其余方法相同。结果表明，当取样量约为0.2 g时，提取率保持在20.50mg·g-1，因此选择0.2 g作为取样量。单因素试验得出硬毛棘豆中总黄酮的最佳提取条件为取样量0.2 g，加70%乙醇25 mL，超声提取60 min。

2.6 响应面优化设计

2.6.1试验设计 选择影响提取工艺的因素乙醇浓度（A）、提取时间（B）、取样量（C），根据Boxbehnken试验设计原理，设计三因素三水平试验，因素及水平编码表（见表2）。

表2 响应面试验因素水平编码表

2.6.2试验结果 依Box-Behnken试验设计17组，进行试验，计算总黄酮的含量（见表3）。

表3 提取条件(A，B，C)对总黄酮含量(Y)的Box-Behnken试验设计及结果

2.6.3回归模型方程的建立及显著性检验通过Design-Expert 10.0.7软件对表3数据分析并进行回归拟合，得到试验实际值的二次回归模型方程：Y=-29.25950+0.97740A+0.50158B+12.60250C+1.47500×10-3AB+0.11250AC-0.055000BC-7.93500×10-3A2-4.86000×10-3B2-41.60000C2。方程模型的相关系数（R2=0.9893，P＜0.0001），说明模型达到极显著（见表4）。同时，离散系数较小，为0.46%。模型失拟项（P=0.2328＞0.05），表明失拟不显著，回归方程与实际情况拟合很好。乙醇浓度二次项（A2）、超声时间二次项（B2）、取样量二次项（C2）对硬毛棘豆中总黄酮含量的影响极显著（P＜0.01）；超声时间（B）、乙醇浓度与超声时间交互项（AB）、乙醇浓度与取样量交互项（AC）对硬毛棘豆中总黄酮含量的影响显著（P＜0.05），说明改变这些因素水平会对响应值产生较大的影响。根据表中F值可知，一次项中对总黄酮含量影响程度主次的因素为：乙醇浓度>提取时间>取样量。

表4 提取条件(A，B，C)对总黄酮含量的回归模型方差分析结果

2.6.4响应面分析 根据上述回归模型得到对应的响应曲面图（见图2）。当固定因素取0水平对应的值时，总黄酮的含量随乙醇浓度、超声时间和取样量的增大均呈现先增后降的趋势，响应面图向上凸出，说明3个因素在所选水平范围内均能产生最佳的响应值。乙醇浓度（A）和提取时间（B）的交互作用及乙醇浓度（A）和取样量（C）的交互作用对硬毛棘豆中总黄酮含量的影响显著，表现为图2Ⅰ、2Ⅱ的等高线图呈椭圆形，而提取时间（B）和取样量（C）的交互作用对总黄酮含量的影响不显著，表现为图2Ш的等高线图接近于圆形。以上结果与表4数据结果一致。

图2 乙醇浓度(A)、提取时间(B)和取样量(C)之间交互作用对总黄酮含量的影响

2.6.5验证实验Design-Expert 10.0.7软件分析获得硬毛棘豆中总黄酮提取的最佳条件为：乙醇浓度为69.5%，超声时间为60.8 min，取样量为0.2 g，在此最佳提取条件下进行3次验证试验（见表5）。试验结果与预测相符，说明运用响应面进行分析的数据可靠性强。

表5 最佳提取条件获得总黄酮含量的预测值与实际值对比

2.7 硬毛棘豆总黄酮的含量测定

取9批硬毛棘豆药材样品约0.2 g，平行3份，精密称定，按“2.2”项下的方法制备供试品溶液，按“2.3”项下的方法显色后，以显色剂为空白，在275 nm处测定吸光度A，计算总黄酮的含量（见表6）。

表6 样品含量测定结果（n=3）

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3 结语

Al（NO3）-NaNO2-NaOH比色法、AgCl3比色法、三乙胺显色法、氢氧化钾显色法等是最为常用的测定中药中总黄酮的方法[7~10]。本研究分别对上述4种方法进行了比较，结果供试品溶液在AgCl3显色法显色后最大吸收峰较为明显，所以将AgCl3显色法定为测定硬毛棘豆总黄酮含量的显色方法，并进行了方法学验证，测定了9批野外采集的硬毛棘豆药材的总黄酮含量。

本实验在单因素试验基础上，运用响应面设计对提取工艺进行进一步优化。以硬毛棘豆中总黄酮含量为指标，通过Box-Behnken响应面设计并进行分析，得出硬毛棘豆中总黄酮的最佳提取条件为乙醇浓度69.5%，超声时间60.8 min，取样量0.20 g，结合实际操作，得到最佳条件下总黄酮含量为（20.84±0.07）mg·g-1，与预测结果相似，证明响应曲面法所构建的模型可靠[11]。实验结果为硬毛棘豆中总黄酮的开发利用提供了参考依据，响应面法优化提取工艺具有一定的指导意义。