黑沙蒿治疗过敏性鼻炎的网络药理学研究

孙国园，朱小玲，贾 鑫，李斌鑫，董 玉

（1.内蒙古自治区国际蒙医医院药学部，内蒙古 呼和浩特 010065；2.内蒙古自治区蒙药药效物质与质量控制工程技术研究中心；3.内蒙古医科大学附属医院药剂部；4.内蒙古医科大学药学院）

黑沙蒿（Artemisaordosica）蒙古名为哈拉-沙巴嘎，又称沙蒿、鄂尔多斯蒿、油蒿、籽蒿，为菊科蒿属植物。在我国主要分布于内蒙古、河北（北部）及山西，具有良好的防风固沙性能[1]。黑沙蒿味辛苦，性微温。据《中华本草》记载，黑沙蒿可祛风除湿、解毒消肿，主治风湿性关节炎、感冒头痛、咽喉肿痛等[2]。研究表明[3]，黑沙蒿的主要活性成分包含黄酮类、挥发油类和三萜类，香豆素类等，可以增强免疫力，提高氧化功能等。近年来大面积飞机播种使黑沙蒿分布更加广泛，据调查，黑沙蒿在我国分布面积达37500万亩[4]。随着黑沙蒿分布面积的扩大，蒿粉过敏引起的过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）和哮喘病例不断增加，严重影响了当地居民的正常生活。有数据显示，全球的过敏性鼻炎患者超过5亿[5]。过敏性鼻炎在我国大陆地区人口中的患病率达到4%～38%，不同地区之间差异较大[6]。过敏性鼻炎主要临床表现为流涕、鼻痒、眼痒、喷嚏、鼻塞和咳嗽等急性过敏反应，严重者会引发过敏性哮喘。目前，西医临床治疗过敏性鼻炎常用抗组胺药、肾上腺皮质激素、减充血剂、肥大细胞稳定剂等，其中抗组胺药、肾上腺皮质激素应用较多，这些药物能控制AR症状却不能根治，而且有副作用。最近，有研究人员评估了黑沙蒿提取物对过敏性鼻炎（AR）和体内抗炎症作用减弱效果，结果表明黑沙蒿提取物能够减轻卵清蛋白（OVA）诱导的AR症状[7]，这为黑沙蒿抗过敏性鼻炎提供了有力的证据。本研究基于网络药理学探寻黑沙蒿的潜在活性成分、靶点及信号通路，阐释黑沙蒿抗AR作用机制，为黑沙蒿治疗AR提供理论依据。

1 应用的软件与方法

1.1 软件（见表1）

表1 软件

1.2 方法

1.2.1化学成分的收集及其靶点的预测 通过查阅文献搜集黑沙蒿的化学成分，将所筛选的化学成分通过Pubchem数据库查询其结构信息，将查询到的化合物结构信息输入Swiss Target Prediction数据库，以Probability≥0.6为条件预测其作用靶点，整合、去掉重复项。

1.2.2疾病靶点的筛选通过TTD、Drugbank、Dis-GeNET数据库筛选出过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的作用靶点。

1.2.3化学成分及AR共同靶点的获取在Venny2.1在线软件上分别导入所选化学成分和AR作用靶点，绘出韦恩图，两者取交集部分，即黑沙蒿抗AR的作用靶点。

1.2.4“成分-靶点”网络的构建与分析将“1.2.1”中收集到的化学成分以及“1.2.3”所获取的抗AR的作用靶点导入Cytoscape3.7.2软件，构建“成分-靶点”相互作用网络，使用Cytoscape对药物中的主要活性成分进行分析，节点的大小代表度值（degree）的大小。

1.2.5PPI网络构建与分析将“1.2.3”所获取的抗AR的作用靶点导入到STRING数据库中，设置蛋白种类为“Homo sapiens”检索，最低相互作用阈值为0.4，得到蛋白相互作用的信息，将其导入到Cytoscape3.7.2软件后绘出PPI网络。

1.2.6通路富集分析用DAVID数据库对潜在作用靶点进行GO（gene ontology）富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，并分析AR的生物过程和信号通路。

2 结果

2.1 黑沙蒿中的化学成分

通过文献检索，获得黑沙蒿中的化学成分20个[1，3，8，9]（见表2）。

表2 化合物名称

2.2 化学成分及AR共同靶点的获取

通过Swiss Target Prediction数据库筛选出化学成分的作用靶点，整合、去掉重复值后得到383个作用靶点。通过TTD、Drugbank、DisGeNE数据库筛选出AR的作用靶点，去掉重复值后得到413个靶点。将所选化合物靶点和疾病靶点导入Venny2.1在线软件上，绘出韦恩图，得到共同靶点63个（见图1）。

图1 黑沙蒿有效成分-AR靶点韦恩图

2.3 活性成分-靶点网络构建

将收集到的黑沙蒿的成分靶点与AR的作用靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，取所有靶点中共同的部分，绘出网络图（见图2），该网络共包括35个节点，183条边，其中绿色节点为化合物分子，红色节点为药物靶点，边为化合物分子与靶点之间的相互关系。图中，度值较大的成分分别是黄酮类化合物Genkwanin（HSH-4，芫 花 素）、hydroxygenkwanin（HSH-5，羟基芫花素）、acacetin（HSH-8，金合欢素），cirsimaritin（HSH-9，滨蓟素）。度值较大的靶点是ACHE（乙酰胆碱酯酶）、ESR2（雌激素受体）、ADORA1（腺苷A1受体）、ADORA2A（腺苷A2A受体）、ALOX5（花生四烯酸5-脂氧合酶）等。每个化合物与多个靶点相关联，同时，一个靶点被多个化合物作用，体现了黑沙蒿多成分、多靶点的作用机制（见图2）。

图2 黑沙蒿活性成分-靶点网络

2.4 PPI网络构建

在STRING数据库中录入黑沙蒿活性成分与过敏性鼻炎（AR）共同靶点，即抗AR的作用靶点，设置蛋白种类为“Homo sapiens”检索，最低相互作用阈值为0.4，得到PPI网络关系数据，输入Cytoscape3.7.2软件，分析并构建PPI网络图。图中，度值越大，节点越大，其在整个网络中就越关键。该网络总共包括13个节点和20条边，其中，靶点EGFR（表皮生长因子受体）的度值最大；其次是MMP9（基质金属肽酶9）、AR（雄激素受体）、AHR（芳香烃受体）（见图3），推测EGFR是黑沙蒿治疗AR的关键靶点。

图3 黑沙蒿治疗AR的蛋白相互作用PPI网络

2.5 基因功能与通路分析

使用DAVID数据库对黑沙蒿活性成分对应靶点进行GO分析和KEGG通路分析，GO富集分析包括生物过程（biological process，BP）、分子功能（molecularfunction，MF）和细胞组分（cellular component，CC）3个分支，PValue值设为小于0.05，并筛选前10个生物过程，用GraphPad Prism 5.0绘图（见图4～6）；共富集到4条通路，红色条形的长短表示基因数目的多少，绿色条形的长短表示P的负对数值，该值越大说明信号通路的显著性越高（见图7）。

图4 黑沙蒿治疗AR的BP富集分析

图7 黑沙蒿治疗AR的KEGG通路分析

黑沙蒿抗过敏性鼻炎的BP富集分析结果（见图4），作用靶点主要涉及细胞增殖（cell proliferation）和凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）等。黑沙蒿抗过敏性鼻炎的CC富集分析结果，靶点主要涉及突触（synapse）和不对称突触（asymmetric synapse）等（见图5）。MF分析结果显示，受体信号蛋白酪氨酸激酶活性（receptor signaling protein tyrosine kinase activity）相关性最大（见图6）。雌激素信号途径（Estrogen signaling pathway）基因数最多，P负对数值最大（见图7）。

图5 黑沙蒿治疗AR的CC富集分析

图6 黑沙蒿治疗AR的MF富集分析

2.6 黑沙蒿治疗AR的活性成分-靶点-通路网络模型

将筛选出的黑沙蒿治疗AR的活性成分、靶点及通路，输入Cytoscape 3.7.2软件，构建“活性成分-靶点-通路”网络图。该图有21个节点，55条边，绿色节点为活性成分，粉色节点为潜在靶点，红色节点为调控通路，边为三者之间的作用关系，节点越大，表明黑沙蒿对AR的影响越深（见图8）。分析结果表明，参与治疗AR的信号通路的关键靶点是CHRM2（毒蕈碱乙酰胆碱受体M2）、ESR2（雌激素受体）、MMP9（基质金属肽酶9）、EGFR（表皮生长因子受体）、SYK（酪氨酸激酶）等，表明它们可能是治疗AR过程中的核心作用靶点。由图可以看出黑沙蒿活性成分通过不同的靶点，不同的调控通路，共同发挥抗AR的作用。

图8 黑沙蒿治疗AR的“活性成分-靶点-通路”

3 讨论

在网络药理学研究过程中，活性化合物筛选大多借助中药系统药理学分析平台（TCMSP）和BATMAN-TCM选取口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18的成分。但是以上系统中没有收录黑沙蒿化合物相关信息，所以本文通过文献收集整理得到黑沙蒿的化学成分。

过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）也称为反应性鼻炎，是一种常见的衰弱性疾病，通常指由IgE介导的鼻黏膜I型变态反应。反应机制是IgE抗体与肥大细胞表面Fc受体（FcεRI）结合，通过FcεRI激活肥大细胞和嗜碱性粒细胞，导致其脱颗粒和脱核合成，引起组胺、白三烯、前列腺素和白介素等炎性介质的释放。组胺可提高局部血流量，使血管的通透性增加，引起组织肿胀、瘙痒，从而引起鼻痒、喷嚏和鼻塞等过敏反应[10]。因此，调控气道上皮细胞释放介质是治疗AR的主要靶点。现代药理研究证明[11]，中蒙药复方、单味药及其提取物可以抑制IgE的形成，也可抑制组胺等炎性介质的释放等。本文筛选得到的主要活性成分Genkwanin（HSH-4，芫花素）、hydroxygenkwanin（HSH-5，羟基芫花素）、acacetin（HSH-8，金合欢素），cirsimaritin（HSH-9，滨蓟素）都属于黄酮类化合物。研究证明黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗氧化自由基、抗炎、镇痛、提高机体免疫力、抗变态反应等多种药理活性。图8中的靶点SYK活化后可调节细胞内信号通路如CJun NH2末端激酶（JNK）途径和有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径[10]。Genkwanin（芫花素）以浓度依赖性方式抑制JNK途径中的磷酸化[12]，阻止通过激活SYK依赖的信号通路而导致的肥大细胞脱颗粒释放组胺、白三烯和细胞因子等炎症介质。Acacetin（金合欢素）不仅能够调节Th17/Treg的平衡[13]，还可以有效抑制鼻粘膜上Th2细胞分泌IL-4等炎症细胞因子[14]，对治疗过敏性鼻炎具有显著的疗效[15]。Duncan F等研究表明，表皮生长因子受体（EGFR）及其酪氨酸激酶（tyrosine kinase）可上调MUC基因表达，参与粘液合成，促进鼻粘膜和下呼吸道杯状细胞增生，EGFR受体通过Th2细胞因子和氧化应激反应增强气道粘液分泌。基质金属肽酶（MMPs）既能降解细胞外基质，又能介导蛋白酶活化和细胞因子分泌，从而影响炎症过程。有研究表明，在炎症反应后期，过敏原刺激鼻腔，导致MMP9的释放。Lim等报道长期过敏原激发可引起鼻粘膜和肺组织相关的气道重塑，同时MMP9和组织金属蛋白酶抑制剂1（Timp-1）表达增加。过敏性鼻炎患者外周血淋巴细胞CHRM2受体蛋白表达明显升高，CHRM2受体表达增加与疾病严重程度相关。过敏性鼻炎中毒蕈碱乙酰胆碱能受体（CHRM2）表达的变化证明了免疫细胞胆碱能系统在过敏性气道疾病中的作用。

KEGG通路分析，富集到4条通路。Lin Hai等研究发现抑制PI3K-Akt signaling pathway（磷脂酰肌醇3激酶信号通路）能有效地抑制肥大细胞的活性，从而稳定肥大细胞膜防止其脱颗粒，抑制组织胺等过敏介质的释放。Fan Z等研究证实，雌激素引起免疫反应偏离，促进Th2极化诱导过敏反应，促进肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱颗粒，引起组胺等炎性介质的释放。雌激素与雌激素受体ESR2（见图8）结合活化雌激素信号通路，能够降低炎症因子水平，减轻细胞浸润。因此，雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）可能是治疗过敏性炎症疾病的关键通路。由此推测黑沙蒿活性成分可能通过雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路等治疗AR。在本研究中，癌症信号通路与膀胱癌通路均与靶点EGFR（表皮生长因子受体）和MMP9（基质金属肽酶9）相关联，可能与AR发病过程有关，具体机制需要后续实验进一步验证。

本文通过网络药理学方法预测了蒙药黑沙蒿有效成分及靶点，并通过生物学分析，构建“活性成分-靶点-通路”关系网络、揭示黑沙蒿活性成分-靶点-通路之间的协同作用，初步探索了黑沙蒿治疗AR的作用机制，为进一步研究黑沙蒿治疗过敏性鼻炎提供理论参考。