肿瘤坏死因子α诱导蛋白3基因多态性与食管癌临床特征相关性研究

黎秀月 苏珍 何艳 邹国荣 曹小龙

[摘要]目的探討肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（TNFAIP3）基因多态性在食管癌癌组织与癌旁组织的分布差异及与临床病理参数的相关性。方法利用聚合酶链式反应（PCR）和一代测序技术，对2016年1月至2019年7月在广州市番禺区中心医院住院的30例食管癌手术患者癌组织与对应癌旁组织中 TNFAIP3基因7个多态性位点（rs2230926、rs5029928、rs5029939、rs610604、rs7753873、rs9494885、rs583522）进行检测。结果分析 TNFAIP3基因的7个多态性位点的不同基因型频率在食管癌患者癌与癌旁组织中的分布，差异无统计学意义（ P >0.05）;各多态性位点不同基因型与患者年龄、性别、肿瘤部位、组织分化、浸润深度、淋巴结转移、临床分期均无相关性。结论 TNFAIP3基因7个多态性位点（rs2230926、rs5029928、rs5029939、 rs610604、rs7753873、rs9494885、rs583522）的基因型频率在食管癌患者癌与癌旁组织分布无差异，不同基因型与食管癌患者临床参数也无相关性。

[关键词]肿瘤坏死因子α诱导蛋白3基因;基因多态性;食管癌;一代测序

[中图分类号] R735.1  [文献标识码] A   [文章编号]2095-0616（2021）24-0192-05

Correlation between tumor necrosis factor-alpha-induced protein3 gene polymorphism and clinical features of esophageal cancer LI  Xiuyue    SU  Zhen    HE  Yan    ZOU  Guorong    CAO  Xiaolong

Department of Oncology， Guangzhou Panyu Central Hospital， Guangdong， Guangzhou 511400， China

[Abstract] Objective To investigate the distribution difference of tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3（TNFAIP3） gene polymorphism between esophageal cancer （EC） tissues and adjacent tissues and its correlation with clinicopathological parameters. Methods Polymerase chain reaction （PCR） and first-generation sequencing technology were used to detect seven polymorphic sites （rs2230926， rs5029928， rs5029939， rs610604， rs7753873， rs9494885 and rs583522） of TNFAIP3 gene in cancer tissues and corresponding adjacent tissues of 30 patients with EC who were hospitalized in Guangzhou Panyu Central Hospital from January 2016 to July 2019. Results The distribution of different genotype frequencies of 7 polymorphic sites of TNFAIP3 gene in cancer and adjacent tissues of EC patients was analyzed， and there was no significant difference （P >0.05）. Different genotypes of each polymorphic site were not correlated with age， gender， tumor location， tissue differentiation， invasion depth， lymph node metastasis and clinical stage. Conclusion There is no difference in the genotype frequency of seven polymorphic loci （rs2230926， rs5029928， rs5029939， rs610604， rs7753873， rs9494885 and rs583522） in the distribution of cancer and adjacent tissues of EC patients， and there is no correlation between different genotypes and clinical parameters of EC patients.[Key words] Tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3 gene; Gene polymorphism; Esophageal cancer; First generation sequencing

肿瘤坏死因子α诱导蛋白3（tumor necrosis factor alpha-induced protein 3，TNFAIP3）是 NF-κB 誘导表达的泛素编辑酶，位于人类染色体6q23，具有去泛素化酶和泛素连接酶的双重生物学功能，通过修饰 NF-κB 信号通路中的一些重要信号蛋白的泛素化状态而发挥调控 NF-κB 表达状态的功能[1-2]。 TNFAIP3基因在人群中呈现不同的多态性位点，已有研究表明 TNFAIP3基因多态性与包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征在内的自身免疫性疾病的疾病易感性和临床病理参数有一定的相关性[3-5]。此外，该基因的多态性位点 rs610604可以作为食管癌预后的独立预测因子[6]。但针对 TNFAIP3基因多态性和食管癌临床特征的关联性研究未见报道。本研究旨在利用一代测序技术对 TNFAIP3基因进行多态性位点分型检测，探讨各多态性位点的不同基因型频率在食管癌癌组织与癌旁组织中的分布差异及与患者临床病理参数的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料

收集2016年1月至2019年7月于广州市番禺区中心医院住院的30例食管癌手术患者的组织蜡块。纳入标准：①患者在本院接受食管癌根治手术，且术后病理结果明确诊断为食管癌;②患者所有临床资料完整;③患者同意配合研究工作。排除标准：①术前已行化疗或放射治疗患者;②合并其他类型恶性肿瘤患者;③转移性食管癌患者。所有患者均依照2010年国际抗癌联盟（VICC）及美国癌症联合会（AJCC）提出的第7版食管癌分期标准进行分期，并选取相应癌旁组织作为对照组[7]。

1.2仪器试剂

Ezup柱式动物组织基因组 DNA 抽提试剂盒（B518251），Taq Plus DNA 聚合酶（B600090），10× PCR Buffer（含 Mg2+）（B600017），dNTP（B500056），琼脂糖（A500016），50× TAE（B548101），DNA Ladder Mix（100～ 3000 bp）（B500347），SanPrep柱式 PCR 产物纯化试剂盒（上海生工生物有限公司， B518141）。使用的仪器包括： PCR 仪（美国 ABI 公司），3730XL 测序仪（ABI 公司），凝胶成像仪（上海复旦科技有限公司），DYY-6C 电泳仪（北京六一）等。

1.3方法

① DNA 提取：收集30例食管癌患者癌组织和对应癌旁组织，严格按照试剂盒说明书进行 DNA 提取。② DNA 质量检测：利用琼脂糖电泳检测提取的 DNA 完整性，分光光度计检测浓度和纯度。③ PCR 扩增：依据引物设计原则设计合适的引物进行 PCR 扩增。PCR 反应体系为：模板 DNA 1?l，上下游引物各1?l，dNTP mix 1?l，Taq Buffer（with  MgCl2）2.5?l，Taq 酶0.2?l，加 ddH20至25?l;反应程序为预变性95℃5 min，接着进入循环步骤变性94℃30 s，退火58℃30 s，延伸72℃60 s，共38个循环，72℃终延伸10 min。④1%琼脂糖电泳检测扩增结果。利用 PCR 产物纯化试剂盒进行胶回收。⑤测序：测序引物由上海生工生物公司合成并进行最后的测序工作，见表1。

1.4统计学方法

采用 SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计数资料用[n （%）]表示，比较采用 Fisher's 精确检验;各多态性位点不同基因型和临床参数的相关性分析，由于样本量较小，采用 Fisher's 精确检验， P <0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1基因分型结果

TNFAIP3基因7个多态性位点经一代测序发现：rs2230926共检测到两个基因型，为 G/T、T/T 型; rs5029928共检测到两个基因型，为 C/C、C/T 型; rs5029939共检测到两个基因型，为 C/C、C/G 型; rs610604共检测到三个基因型，为 G/G、G/T、T/T 型; rs7753873共检测到两个基因型，为 A/A、A/C 型;rs9494885 共检测到两个基因型，为 C/T、T/T 型;rs583522共检测到两个基因型，为 C/T、T/T 型。见图1。

2.2 TNFAIP3多态性位点基因型频率分布

7个多态性位点的不同基因型频率在食管癌癌组织与癌旁组织间分布比较，差异无统计学意义（ P >0.05）。见表2。

2.3 TNFAIP3基因多态性与食管癌临床病理特征的相关性分析

本研究中，将食管癌常见的临床病理参数（患者年龄、性别、肿瘤部位、组织分化、浸润深度、淋巴结转移、临床分期）分别与不同的多态性位点进行相关性分析，未发现多态性位点的基因型分布与临床病理参数间存在显著的相关性，见表3～9。考虑可能由于本研究纳入的样本量太少所致。

3讨论

食管癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，位于全球癌症相关性死亡原因的第6位[8]。我国食管癌发病率占全球发病率一半以上[9]。目前对食管癌的研究主要集中在环境危险因素、饮食状况、精神因素及是否喜好烟酒等方面。随着分子生物学与细胞生物学等技术的快速发展，各国学者对食管癌的研究方向从环境因素逐步深入到分子水平的遗传因素。基因多态性是指生物群体中同时存在两种或以上不连续的基因型或等位基因[10]。大量研究表明，基因多态性研究对帮助阐明疾病易感性，预测疾病预后等方面都具有十分重要的意义[11-13]。迄今已有大量研究表明基因多态性与食管癌之间存在一定的相关性[14-15]。

既往研究表明 TNFAIP3基因在食管鳞癌患者中高表达，且可作为食管鳞癌的独立预后危险因子[16]。另有文献报道食管癌中 TNFAIP3基因 rs583522位点的不同基因型与疾病复发率存在一定的相关性，AA/AG 基因型比 GG 基因型的患者更易复发[17]。本研究通过一代测序技术对符合纳入标准的30例食管癌患者癌组织与癌旁组织中 TNFAIP3基因的7个多态性位点（rs2230926、 rs5029928、rs5029939、rs610604、rs7753873、 rs9494885、rs583522）进行检测，并对各基因型频率在癌组织和对应癌旁组织中的分布差异进行统计分析，研究结果显示各多态性位点的基因型频率在癌与癌旁组织中分布差异无统计学意义。分析各多态性位点与常见临床病理参数（患者年龄、性别、肿瘤部位、组织分化、浸润深度、淋巴结转移、临床分期）的相关性，尚未发现与这些参数有明显相关性的多态性位点。综上所述，结合已有相关研究，本研究尚未发现 TNFAIP3基因的7个多态性位点不同基因型频率在鼻咽癌组织和癌旁组织间有明显的统计学差异。各多态性位点与临床常见病理参数之间也尚未发现明显相关性。这与前期相关文献报道并不吻合，考虑可能由于样本量太少的原因，后期将通过扩大样本量进一步收集数据分析。

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（收稿日期：2020-11-30）