甘薯IbHKT-like基因的克隆与表达分析

蒋薇 靳容 刘明 赵鹏 张爱君 王丹凤 李铁鑫 范文静 唐忠厚

摘要： 植物高親和钾转运体HKT基因具有Na+（或K+）单向运输或Na+-K+共转运作用。为了探究甘薯高亲和钾转运体HKT的离子转运情况及其对非生物胁迫的响应，本研究克隆得到1个甘薯钾离子转运体IbHKT-like 基因。生物信息学分析结果表明，IbHKT-like基因序列全长为1 647 bp，编码548个氨基酸。IbHKT-like蛋白有2个TrkH（细菌钾转运系统Trk亚基）保守结构域，10个跨膜片段。进化树分析结果表明，IbHKT-like蛋白与旋花科的矮牵牛InHKT6氨基酸序列十分相似，相似度为90.63%。亚细胞定位结果显示，IbHKT-like蛋白主要定位在细胞质膜，在叶绿体中存在少量分布。组织特异性分析结果表明，IbHKT-like基因在叶中表达量最高。实时荧光定量PCR结果显示，IbHKT-like基因的表达受到低温、干旱、高盐及过氧化氢胁迫的诱导，说明IbHKT-like基因可能在甘薯抵御非生物胁迫中发挥着重要的作用。

关键词： 甘薯;IbHKT-like基因;基因克隆;表达分析;亚细胞定位

中图分类号： Q786   文献标识码： A   文章编号： 1000-4440（2021）04-0831-08

Cloning and expression analysis of IbHKT-like gene in sweet potato

JIANG Wei1， JIN Rong1， LIU Ming1， ZHAO Peng1， ZHANG Ai-jun1， WANG Dan-feng1， LI Tie-xin2，FAN Wen-jing2， TANG Zhong-hou1

（1.Xuzhou Institute of Agricultural Sciences of Xuhuai District of Jiangsu Province/Sweet Potato Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Xuzhou 221131，China;2.College of Agronomy，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Abstract： The plant high affinity potassium transporter HKT gene had Na+ （or K+） unidirectional transport effect or Na+-K+co-transport effect. To explore the ion transport of high affinity potassium transporter HKT in sweet potato and its response to abiotic stress， a potassium transporter IbHKT-like gene of sweet potato was cloned in this study. Results of bioinformatics analysis showed that， the full length of IbHKT-like gene sequence was 1 647 bp， encoding 548 amino acids. The IbHKT-like protein had two TrkH （Trk subunit of potassium transport system in bacteria） conservative domains and ten transmembrane fragments. Results of evolutionary tree analysis showed that， the amino acid sequence of IbHKT-like protein was very similar to that of InHKT6 in petunia of Convolvulaceae， with the similarity of 90.63%. Subcellular localization showed that， the IbHKT-like protein mainly located in the cytoplasmic membrane and rarely located in the chloroplast. Results of tissue-specific analysis showed that， the expression quantity of IbHKT-like gene was the highest in the leaves. The results of real-time fluorescent quantitative PCR showed that， the expression of IbHKT-like gene was induced by low temperature， drought， high salinity and hydrogen peroxide， indicating that IbHKT-like gene may play an important role in the resistance of sweet potato to abiotic stress.

Key words： sweet potato;IbHKT-like gene;gene cloning;expression analysis;subcellular localization

钾元素约占地壳总质量的2.1%～2.3%，是地球上第七大元素，同时钾作为作物生长所必需的大量矿质营养元素之一，对于作物的生长、产量、品质以及作物对非生物环境胁迫的适应均十分重要[1]。但中国土壤中有效钾含量偏低，且低钾胁迫现象在中国甘薯种植区十分普遍，成为甘薯优质高产的主要制约因素之一。

高亲和钾离子转运体HKT（High-affinity K+ transporter）是Na+（K+）单向转运体或Na+-K+共转运体的总称，它由N端短胞质区、C端短胞质区及1个带有4个重复MPM基序（1TMS-1P-1TMS）区域的疏水核心结构组成，每个基序由2个跨膜区域和1个保守的成孔结构域（P-loop）组成。4个P-loop最终排列形成中心的渗透路径[2]。根据异源表达系统的功能研究和系统发育分析，在被子植物中，HKT家族可分为2个亚家族。亚家族I和亚家族II的离子选择特性取决于HKT转运蛋白第1个PA-loop保守位点的氨基酸。亚家族I的4个P-loop保守位点的氨基酸为丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（Ser-Gly-Gly-Gly），主要存在于双子叶植物中，具有Na+转运功能;亚家族II的4个P-loop保守位点的氨基酸为甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（Gly-Gly-Gly-Gly），主要存在于单子叶植物中，亚家族II不仅是K+-Na+共转运体，在外界环境影响下，亦可作为Na+或K+单向转运体[3]。

迄今为止，人们已对拟南芥[4-5]、水稻[6-7]、小麦[8-9]、小花碱茅[10-11]、胡杨[12]等多种作物的HKT蛋白进行了克隆和分析，HKT转运体的K+运输功能主要在异源表达系统得到验证，小麦TaHKT1转运体参与钾离子运输[13]，在大肠杆菌、酵母的缺陷体中过表达McHKT1、OsHKT1基因，能够弥补钾离子吸收缺陷[14-16]。AtHKT1基因通过在拟南芥根中过表达来减少Na+向叶运输，降低叶中Na+浓度。OsHKT8（SKC1）基因参与韧皮部汁液的再循环过程，将Na+从地上部转移至根中，降低Na+浓度，进而提高作物的耐盐性[17-18]。

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]广泛栽培于热带、亚热带地区，具有耐贫瘠、适应性强等特性，是一种重要的“喜钾”粮食作物。在甘薯中，一些HKT家族基因已被克隆研究，Park等[19]在研究烟草瞬时表达时发现IbHKT1基因能吸收钠离子，酵母互补试验发现IbHKT1在没有氯化钠存在的情况下能吸收钾离子。本课题组前期通过转录组数据共挖掘了4个IbHKT基因[20]，通过qRT-PCR分析发现IbHKTs受低钾诱导表达，且在不同耐低钾甘薯品种中的表达量存在差异。但目前对于甘薯吸收和转运钾离子的机理尚不清楚。本研究在此基础上，再次克隆得到1个甘薯IbHKT-like基因，并对其进行了生物信息学分析、表达模式分析和亚细胞定位，为甘薯IbHKT-like基因的功能鉴定及甘薯耐低钾分子机制研究奠定基础。

1 材料與方法

1.1 试验材料

本试验所用甘薯品种为徐薯32号（由江苏徐州甘薯研究中心育成）和普薯32号（由普宁市农业科学院育成），试验材料种植于苗圃温室，常规管理。

1.2 IbHKT1基因克隆

根据课题组前期甘薯转录组测序数据获得IbHKT-like基因序列，设计IbHKT-like 基因特异性的上游引物和下游引物（表1），进行PCR扩增。采用生工生物工程（上海）股份有限公司Taq PCR Mix（2×，含蓝染料）试剂盒配制反应体系。反应程序：94 ℃预变性10 min;94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 生物信息学分析

利用在线工具Pfam（http：//pfam.xfam.org）和TMHMM Server v.2.0（http：//www.cBMs.dtu.dk/services/TMHMM/）对甘薯IbHKT-like氨基酸序列进行保守结构域和跨膜结构域预测。通过NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）获得其他物种的同源HKT氨基酸序列，并利用DNAMAN 9.0对甘薯IbHKT-like蛋白及其他物种同源HKT蛋白的氨基酸序列进行多重序列比对，然后采用MEGA 7.0的邻近法（Neighbor-joining method，NJ）构建系统进化树，Bootstrap设置为1 000次重复。

1.4 基因表达模式分析

将大田剪取的25～30 cm长势一致的普薯32号幼苗水培，待甘薯幼苗长根且顶部长出新叶后，进行如下胁迫处理：（1）低温胁迫，放入4 ℃光照培养箱水培处理;（2）干旱胁迫，放置于无水空瓶中进行干旱培养处理;（3）过氧化氢处理，用30% H2O2喷洒叶面并水培处理;（4）盐胁迫，用300 mmol/L NaCl水培处理，分别于处理后2 h、12 h取幼苗从上至下第3、第4张展开叶，用液氮速冻，按照捷瑞动物总RNA快速提取试剂盒说明书提取总RNA，再用宝生物工程（大连）有限公司（PrimeScript RT reagent Kit with gDNAEraser）试剂盒将其反转录成cDNA备用。提取田间正常生长的徐薯32的叶、茎、根（毛根、柴根、块根）的RNA，进行组织特异性分析。

利用实时荧光定量PCR分析不同胁迫处理下不同时间点IbHKT-like基因的表达情况。该试验用Step One Plus（美国应用生物系统中国公司产品）定量仪完成。反应体系（10.0 μl）：ddH2O 2.2 μl、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（日本东洋纺株式会社产品）5.0 μl、上游引物0.4 μl、下游引物0.4 μl、模板cDNA 2.0 μl。反应程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s，57 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40个循环。以IbARF为内参基因，测得数据经内参基因均一化处理，以2-△△Ct法计算待测基因相对表达量。使用Primer Premier 5.0设计的引物序列见表1。数据分析采用单因素方差分析，通过SAS 9.4完成，利用最小显著性差异法（LSD）在0.05的显著水平上进行多重比较。

1.5 IbHKT-like-GFP瞬时表达载体构建及亚细胞定位

PCR产物经检测、胶回收、纯化后，连接到pCAMBIA1301s载体的35S启动子与绿色荧光蛋白（GFP）基因序列中间，构建p35S-IbHKT-like-GFP-NOS融合表达载体，继而转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将菌液PCR验证为阳性单菌落的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。以GFP空载体为对照，转化农杆菌EHA105，接种至含有50 mg/L利福平（Rif，Rifampicin）和200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）的LB液体培养基中，28 ℃摇菌至OD600值为0.8～1.0，4 000 r/min离心10 min，用含200 μmol/L AS的浸润介质（MES 100 mmol/L、MgCl2 100 mmol/L，pH=5.6）洗涤1次，再重悬。注射42 d苗龄的烟草叶片，3 d后利用激光共聚焦显微镜[卡尔蔡司光学（中国）有限公司产品，型号LSM 7DUO]观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 甘薯IbHKT-like基因的克隆

通过设计引物（IbHKT-like基因序列的5′端20 bp为上游引物，3′端20 bp的反向互补序列为下游引物），经PCR扩增、电泳后获得大小约为1 600 bp的目的条带（图1），产物经过回收、测序、比对，将该基因命名为IbHKT-like基因。IbHKT-like基因cDNA全长为1 647 bp，编码548个氨基酸。

2.2 IbHKT-like基因编码的蛋白质信息分析

将IbHKT-like蛋白与甘薯IbHKT1、烟草NtHKT1、拟南芥AtHKT1、水稻OsHKT6及马铃薯StHKT1氨基酸序列进行比对。比对分析结果（图2）表明，除了编码保守结构域的氨基酸，IbHKT-like蛋白与其他物种的同源HKT序列在其他非编码保守结构域氨基酸区域的差异较大。通过Pfam网站保守结构域预测，发现该蛋白质在第200～412和第435～535个氨基酸之间有2个细菌钾转运蛋白Trk系统的亚基——TrkH保守结构域。经过蛋白质跨膜结构域预测发现，该序列共有10个跨膜片段（图3），可能具有钾离子转运功能。

2.3 IbHKT-like蛋白进化树分析

通过NCBI得到矮牵牛InHKT6（Ipomoea nil，XP_019188746.1）、甘薯IbHKT1（Ipomoea batatas，AMY98959.1）、烟草NtHKT1（Nicotiana tabacum，XP_016457809.1）、拟南芥AtHKT1（Arabidopsis thaliana，OAO98616.1）、木薯MeHKT1（Manihot esculenta，XP_021620110.1）、大豆GmHKT1（Glycine max，XP_006582258.1）、小麥TaHKT8（Triticum aestivum，ABG33945.1）、水稻OsHKT6（Oryza sativa，XP_015626193.1）、马铃薯StHKT1（Solanum tuberosum，XP_006359731.1）、葡萄VvHKT1（Vitis vinifera，RVW85979.1 ）、芝麻SiHKT1（Sesamum indicum，XP_011077901.1）、枸杞LbHKT1（Lycium barbarum，AXY40149.1）、茄子ScHKT1（Solanum cornutum，CCJ09643.1）、番茄SlHKT1（Solanum lycopersicum，NP_001295273.1）的氨基酸序列，与IbHKT-like蛋白的氨基酸序列进行比对，并通过邻近法构建系统进化树（图4），发现IbHKT-like蛋白与旋花科矮牵牛的氨基酸序列十分相似，相似度为90.63%，但与甘薯IbHKT1蛋白关系较远，相似度为61.00%，与拟南芥存在一定的进化距离，相似度为48.19%。

2.4 甘薯IbHKT-like基因表达模式分析

对徐薯32号不同部位进行实时荧光定量PCR分析，结果表明，IbHKT-like基因在甘薯不同组织中存在明显的表达特异性，在叶中表达量最高，在毛根中表达量最低（图5）。叶和茎中的表达量分别为毛根的80倍和12倍。

对胁迫处理后的普薯32号进行荧光定量PCR分析，发现IbHKT-like基因受低温、干旱、盐胁迫及过氧化氢处理诱导（图6）。胁迫处理后，IbHKT-like基因表达量相比对照整体呈现上升趋势;IbHKT-like基因受到低温胁迫诱导在短时间内大量表达，在干旱胁迫下可以持续表达，在盐胁迫及过氧化氢处理下IbHKT-like基因表达量随时间延长而上升。上述结果说明IbHKT-like基因响应甘薯非生物胁迫。

2.5 甘薯IbHKT-like蛋白亚细胞定位

为了明确IbHKT-like蛋白在细胞中的定位，将IbHKT-like基因整合到带有GFP荧光标记的pCAMBIA1301s载体上，得到p35S-IbHKT-like-GFP融合表达载体（图7）。以GFP空载体为阳性对照，通过农杆菌介导其在烟草叶片中表达，利用激光共聚焦显微镜进行观察。从图8可以看出，细胞质膜上及叶绿体中有强烈的荧光信号，说明IbHKT-like蛋白主要定位在细胞质膜上，少量分布于叶绿体中，表明IbHKT-like蛋白具有跨膜转运功能。

3 讨论

植物在长期进化过程中，形成了一套相对完善的机制来响应非生物胁迫，从而适应不利的生长环境，植物Na+/K+平衡就是个很好的例子。植物HKT钾转运体由原核生物钾离子通道亚基进化而来，与真菌Trk、细菌Ktr形成了一个膜转运系统的超家族，该家族可转运钠离子、钾离子等一价阳离子[21]。

据前人研究可作出如下假设：植物HKT转运体具有8个跨膜结构域及4个P-loop环[22-23]。生物信息学分析发现甘薯IbHKT-like基因具有10个跨膜结构域，同时多序列分析结果表明IbHKT-like蛋白与其他植物中的HKT蛋白氨基酸序列相似，都包含2个HKT家族钾转运蛋白保守结构域TrkH[24]。经过多序列比对及系统进化树分析，发现IbHKT-like基因编码的蛋白质与矮牵牛InHKT6位于同一分支，相似度达90.63%。在植物学分类上，矮牵牛与甘薯同属于旋花科，亲缘关系相近，聚类分析结果与物种分类结果一致。但与亚家族I的拟南芥AtHKT1蛋白相似度为48.19%。本研究发现的IbHKT-like與之前报道的IbHKT1蛋白氨基酸序列（包含11个跨膜结构域）存在较大差异[19]，相似度为61.00%，且系统进化距离较远;与本课题组前期研究的HKT基因家族中的IbHKT3蛋白极为相似，但在非编码区多了93个氨基酸[20]。根据结构域分析和比对结果推测IbHKT-like为钾离子转运蛋白，参与甘薯生长发育过程中离子转运。前人研究报道HKT转运体定位在细胞质膜上[25-26]，本研究亚细胞定位分析结果表明，IbHKT-like蛋白主要定位在细胞质膜上，少量分布于叶绿体中，推测其通过参与细胞器及细胞间的离子交换来维持细胞稳态。

不同的HKT转运体之间的表达模式和组织定位差异显著，如GmHKT6;2在根、茎、叶中均表达[27]，表明HKT转运体在不同部位具有不同的生理功能;TaHKT1主要在根和叶中表达，帮助植物根系从土壤中吸收钾离子，运输到叶片[28];AtHKT1在拟南芥柱鞘及维管束中大量表达，减少Na+由根至叶的运输[14]。本研究发现IbHKT-like基因在叶中表达量最高，与水稻OsHKT1;1、OsHKT1;3、OsHKT2;3以及OsHKT2;4基因的表达规律一致[29]，可能在离子的长距离运输及再分配中起重要作用。

外源性过氧化氢（H2O2）、高盐等非生物胁迫引起的氧化应激会导致活性氧（ROS）的产生，加剧氧化应激损害，植物常常通过不同代谢途径来清除ROS带来的伤害[30-31]。在拟南芥中过表达AtHKT1;1能减少叶中Na+含量，保护光合器官免受伤害[32];同样的，TaHKT1;5-D在根中介导Na+从木质部中的卸载，且限制Na+从根到叶的转运，从而降低植株地上部Na+的含量以保护叶片免受盐胁迫[33-34]。在低钾胁迫下，HvHKT2;1在K+吸收或再吸收过程中发挥作用，保持细胞Na+/K+平衡，从而维持植株正常生长发育[35];小花碱茅PutHKT1;2在根中表达量最高[11]。实时荧光定量PCR结果表明，IbHKT-like基因受到低温、干旱、高盐和H2O2等多种胁迫诱导表达，推测IbHKT-like基因通过调节细胞离子稳态，提高甘薯的耐逆性，进而适应逆境。

本研究分析了甘薯钾离子转运体IbHKT-like蛋白序列信息，发现其有2个TrkH保守结构域，10个跨膜片段。IbHKT-like蛋白与旋花科的矮牵牛InHKT6氨基酸序列十分相似。IbHKT-like蛋白主要定位在细胞质膜上。组织特异性分析结果表明，IbHKT-like基因在叶中表达量最高。实时荧光定量PCR结果显示，IbHKT-like基因受到低温、干旱、高盐及过氧化氢诱导表达，说明IbHKT-like基因在抵御非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究为下一步研究甘薯IbHKT-like基因在非生物胁迫下的功能及调控机理奠定了基础。

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（責任编辑：陈海霞）

收稿日期：2020-12-06

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFD1000704）;国家自然科学基金项目（31771721）;国家甘薯产业技术体系项目（CARS-11）

作者简介：蒋 薇（1996- ），女，江苏常州人，硕士研究生，主要从事甘薯栽培生理与生态研究。（E-mail）1298081288@qq.com

通讯作者：唐忠厚，（E-mail）zhonghoutang@sina.com