香鳞毛蕨DfGNOM基因的克隆及其表达分析

邱晓杰，汤 珣，官亚琳，张冬瑞，苏 颖，常 缨*

(1 东北农业大学 生命科学学院，哈尔滨 150030；2 北京师范大学 南山附属学校，广东 深圳 518000)

小G蛋白(small G protein)作为一种“分子开关”在真核生物的生命活动中起着重要的作用，它调控了多种信号转导途径，并与蛋白质的分配运输、细胞骨架的形成以及细胞分化有着密切联系[1-2]。GNOM是介导小G蛋白从非活性状态(ARF-GDP)转变/转换为活化状态(ARF-GTP)的关键因子，处于活化状态的小G蛋白能够与效应器分子作用而共同完成相应的生理功能[3]，同时参与ADP 核糖基化因子(ADP-ribosylation factor，ARF)的活化来调控细胞内蛋白的囊泡运输和生物膜转运，进而影响生物的生长发育和对生物胁迫的抗性[2,4]。据报道，GNOM是冷胁迫反应途径的重要组成部分；GNOM的过度表达和膜定位的改变通过调节细胞内生长素的稳态来增强拟南芥(Arabidopsisthaliana)的抗寒性[5]。研究发现，在转基因拟南芥中过表达AtGNOM，通过调节细胞内生长素的稳态赋予转基因植株对低温胁迫的耐受性[5]。GNOM是ARF-GEF家族成员之一，定位于细胞的内体，参与蛋白的分拣[2]，是蛋白质的内质网-高尔基运输所必需的成员[6-8]，与植物的生长发育和生长素的正常运输相关[9-11]。AtGNOM突变体植株产生gnom胚胎畸形，胚根缺失[12]等现象。AtGNOM蛋白可以通过介导乳突合成关键元件 PEN1 的运输，从而提高植物对非生物胁迫的抗性，该过程需要 SA、JA 和 ET 等信号转导途径的参与[13-14]。小麦(Trticumaestivum)TaGNOM1基因在不同非生物胁迫(高温、低温和高盐)和外源ABA呈现不同的表达模式[15]，但是其参与非生物胁迫(高温、低温、干旱和高盐等)和植物激素(ABA、SA、Eth、IAA和MeJA等)的机制尚不清楚，有待进一步探索。

香鳞毛蕨(Dryopterisfragrans)是鳞毛蕨科鳞毛蕨属植物，具有抗真菌、抗肿瘤、抗过敏、治疗银屑病和类风湿性关节炎等作用[16-22]，是一种非常珍贵的药用草本植物，多生长于高寒地区的滑石坡、森林中的碎石坡上和火山周围的岩浆缝隙中[23]。因此，香鳞毛蕨是在蕨类植物中研究DfGNOM基因抗逆功能的珍贵材料。本研究克隆了DfGNOM基因，通过qRT-PCR检测DfGNOM基因在不同组织以及不同胁迫下的表达，为深入研究香鳞毛蕨DfGNOM基因的生物学功能奠定基础，同时也为探索香鳞毛蕨的抗逆机制提供参考。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究所用的香鳞毛蕨为人工快繁的孢子体幼苗，培养温度为22 ℃，相对湿度50%左右，光周期条件为(光照/黑暗)16 h/8 h[24]。

取幼苗数株，流水冲洗植株表面，用吸水纸吸干水分，对照组叶片喷洒蒸馏水，实验组分别为叶片喷洒10 μmol·L-1IAA、10 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1MeJA和500 μmol·L-1ETH等4种激素，整株浇灌200 mmol·L-1NaCl、20% PEG3350，以及42 ℃高温和4 ℃低温处理，在处理0、0.5、1、3、6、12、24和48 h后分别取样。取样时将样品剪成1 cm小段并包装，置于液氮中速冻后放-80 ℃冰箱中备用。

1.2 方 法

1.2.1 总RNA提取及cDNA合成香鳞毛蕨不同组织的总RNA提取，包括根、叶柄以及叶片，采用Trizol法(擎科,中国哈尔滨)参考说明书进行。cDNA合成采用反转录试剂盒(擎科,中国哈尔滨)说明书进行。

1.2.2DfGNOM基因克隆在香鳞毛蕨转录组中利用拟南芥中的AtGNOM基因进行Blast，获得DfGNOM基因CDS全长。根据基因全长设计正、反向引物以及进行拼接的正、反向引物，引物序列详见表1，扩增目的基因。用反转录的cDNA作为模板进行实时荧光定量PCR，PCR体系为：①1 μL模板DNA，1 μL CDS正向引物，1 μL拼接反向引物，10 μL 2×Taq酶缓冲液，加灭菌水补至20 μL。②1 μL模板DNA，1 μL 拼接正向引物，1 μL CDS反向引物，10 μL 2×Taq酶缓冲液，加灭菌水补至20 μL。③1 μL①模板DNA，1 μL②模板DNA，CDS正、反向引物各1 μL，10 μL 2×Taq酶缓冲液，加灭菌水补至20 μL。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，30个循环；最后4 ℃保温。每个样品重复3次。扩增引物纯化回收后，对其进行琼脂糖凝胶电泳，然后将其连接到克隆载体pEASY-T18上，经过菌落以及菌液PCR检测后送往哈尔滨睿博生物技术有限公司进行测序。所用PCR引物由哈尔滨擎科生物技术有限公司合成。

表1 试验所用引物

1.2.3 生物信息学分析利用ExPASy-ProtParam tool对DfGNOM蛋白的氨基酸序列进行组成成分以及理化性质的分析，并利用在线软件进行DfGNOM亚细胞定位、信号肽、跨膜区和保守基序(motif)等预测。具体网站详见表2。

表2 生物信息学分析所用网址

运用NCBI中的Blastp进行其他物种的GNOM蛋白同源氨基酸序列检索，使用DNAMAN进行GNOM蛋白的氨基酸序列同源比对，获得序列再利用MEGA7.0软件构建系统进化树，分析其与其他物种之间的进化关系。

1.2.4DfGNOM的表达分析DfGNOM基因的qRT-PCR特异引物使用Primer Premier 5.0软件进行设计，并以Df18sRNA为内参基因，所用引物序列详见表1。PCR反应试剂为SYBR Premix Ex TaqTM(擎科，中国哈尔滨)，实时荧光定量PCR反应系统为Mx- 3000p Real-Time PCR System。反应体系及程序参考试剂说明书，采取2-ΔΔCt法计算待测基因的相对表达量。实验进行3次生物学重复。所用引物由哈尔滨擎科生物技术有限公司合成。数据显著性分析采用SPSS 26.0软件。

2 结果与分析

2.1 DfGNOM基因的获得

根据设计出的DfGNOM基因的CDS引物以及拼接引物，对目的基因进行扩增，电泳结果与目标片段长度基本一致，拼接序列上游、拼接序列下游以及基因全长分别为2 220、2 120和4 338 bp(图1)。

M.DL5000; 1.拼接序列上游; 2. 拼接序列下游; 3.DfGNOM图1 DfGNOM基因的RT-PCR扩增M. DL5000; 1. Upstream of splicing sequence; 2. Downstream of splicing sequence; 3. DfGNOMFig.1 RT-PCR of DfGNOM gene

2.2 DfGNOM蛋白质的理化性质

DfGNOM基因4 338 bp，共编码1 445个氨基酸。经ExPASy-ProtParam tool在线预测DfGNOM蛋白的一级结构结果表明，相对分子质量为161.13 kD，理论等电点(PI)为5.67，为酸性蛋白；其不稳定系数为50.12，属于不稳定蛋白质；保守结构域预测显示，DfGNOM蛋白第561～745个氨基酸为sec7。DfGNOM蛋白的信号肽以及跨膜结构域预测分析显示，DfGNOM蛋白无信号肽和跨膜结构域；利用Softberry在线程序对DfGNOM蛋白预测结果显示，DfGNOM定位于细胞质中。

2.3 DfGNOM蛋白质多序列比对、系统进化树和motif分析

经过DNAMAN9.0软件进行多序列比对显示，香鳞毛蕨GNOM蛋白质与江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)的GNOM蛋白质相似性分别为68.10%、60.69%和59.82%。在DfGNOM蛋白质序列中561～745 为sec7保守结构域(图2)。

黑色下划线为sec7结构域图2 DfGNOM蛋白质多序列比对The black underlined is the sec7 domainFig.2 Multiple sequence alignment of DfGNOM protein

利用MEGA7.0软件对江南卷柏、阿月浑子(Pistaciavera)、川桑(Morusnotabilis)等物种与香鳞毛蕨DfGNOM蛋白质序列进行比对分析，进化树结果如图3所示，香鳞毛蕨DfGNOM与江南卷柏SmGNOM的亲缘关系较近，与麻风树和蓖麻等植物的GNOM关系较远。

经在线分析软件MEME对DfGNOM蛋白质的保守motif进行预测(图3)，DfGNOM蛋白含有15个motif，每个motif的长度均为50 aa。motif功能分析表明，motif 1、3、8中含有sec7结构域，motif 2、9、12与高尔基体运输功能相关。香鳞毛蕨与江南卷柏和玉米中的GNOM蛋白具有相同的motif。

2.4 DfGNOM基因的组织表达分析

为进一步推测DfGNOM基因的功能，以Df18sRNA为内参，采用qRT-PCR分析DfGNOM基因在香鳞毛蕨根、叶柄和叶中的表达(图4)。其中，DfGNOM基因在香鳞毛蕨叶片中相对表达量最丰富，其次是叶柄，而根中的相对表达量较低，但是后两者差异不显著。

不同字母表示处理间显著差异(P<0.05)图4 香鳞毛蕨不同组织中DfGNOM的相对表达Different letters indicated significant differences among treatments (P < 0.05)Fig.4 Relative expression of DfGNOM in different tissues of D. fragrans

2.5 植物激素处理后DfGNOM基因的表达特性

在IAA、ABA、MeJA和ETH等4种植物激素处理下，对香鳞毛蕨叶片中DfGNOM的表达进行了qRT-PCR分析。结果(图5)表明，DfGNOM的相对表达量在4种植物激素处理后均发生改变。其中，在10 μmol·L-1IAA处理下，DfGNOM的相对表达量总体表现为上调，在48 h显著高于对照；在10 μmol·L-1ABA处理下，DfGNOM的相对表达量总体上呈下调，但在6 h处理下显著高于对照；在100 μmol·L-1MeJA和500 μmol·L-1ETH处理后，DfGNOM相对表达量的变化趋势正好相反。在MeJA处理12 h后，其相对表达量大约是0 h的2.5倍。DfGNOM相对表达量在ETH所有处理时间均明显下调且显著低于对照，于48 h达到最低，大约是0 h的1/5(图5)。

处理内不同小写字母表示处理时间之间在0.05水平存在显著性差异，下同图5 不同植物激素处理下香鳞毛蕨叶片中DfGNOM的相对表达The different normal letters within same treatments indicate significant difference among times at 0.05 level, the same as belowFig.5 Relative expression of DfGNOM in D. fragrans leaves under different plant growth regulator stresses

2.6 不同非生物胁迫处理后DfGNOM基因的表达特性

在干旱、NaCl、高温和低温处理下,对香鳞毛蕨叶片中DfGNOM的表达进行了qRT-PCR分析。结果(图6)表明，在干旱处理下，DfGNOM基因随着处理时间的增加，其相对表达量呈现“升-降-升-降”的变化趋势，在1 h时达到峰值。NaCl处理后呈

图6 不同非生物胁迫处理香鳞毛蕨叶片中DfGNOM的相对表达Fig.6 Relative expression of DfGNOM in D. fragrans leaves under different abiotic stresses

现“降-升-降”的变化趋势。在高温处理下，DfGNOM基因相对表达量在0.5 h时达到峰值，约为0 h的8倍，而其他处理时间下均低于0 h。与0 h相比，低温处理0.5、48 h后相对表达量有显著差异，处理1～24 h相对表达量无明显差异。本研究结果显示，非生物胁迫对DfGNOM的表达有影响，说明在香鳞毛蕨面对非生物胁迫时DfGNOM可能具有一定调节功能。

3 讨 论

GNOM编码小G蛋白的GDP/GTP交换因子，参与GTP酶的激活，导致结合的GDP从GTP酶中解离[25]。ARF-GEFs高度保守的sec7结构域促进了ARF的结合和GDP/GTP交换，该结构域有助于通过膜运输招募效应蛋白[26]。本研究克隆和鉴定了香鳞毛蕨中GNOM的同源基因DfGNOM，综合多序列比对和系统发育树，该基因编码的蛋白含有sec7 保守结构域，与江南卷柏和玉米的GNOM具有高度同源性。另外，在保守motif分析中除了发现sec7结构域，还发现了关于鸟嘌呤核苷酸交换因子在高尔基体转运N端和关于Ⅲ类细胞色素C家族的结构域，证实DfGNOM是属于香鳞毛蕨ARF-GEF基因家族的成员。本研究鉴定的DfGNOM的保守结构域可能为后续该基因的功能研究提供依据和参考。

关于对GNOM的组织表达特异性目前在拟南芥、水稻、大麦(Hordeumvulgare)和小麦等植物中有报道[15]。有研究表明，GNOM可能在不同的组织中发挥不同的作用[11,27]。本研究中，DfGNOM基因在香鳞毛蕨地上及地下等不同组织中均表达。因此DfGNOM基因可能参与调节香鳞毛蕨体内物质的运输从而影响植株生长。

目前关于GNOM的研究主要集中在拟南芥，认为其是通过参与植物的囊泡运输来影响植物的生长发育[28-30]。本实验结果表明，在外源激素IAA处理下，香鳞毛蕨叶片中DfGNOM的相对表达量总体上调。在外源激素ETH处理下，香鳞毛蕨叶片中DfGNOM在所有时间处理后其相对表达量均显著低于对照。这说明DfGNOM与乙烯以及生长素信号途径有明显关系，与脱落酸等信号途径关系不明显。此外，GNOM在植物受到非生物胁迫时，可以通过调控植物囊泡运输，从而影响植物的抗逆性[31-33]。本试验研究表明，在低温处理下，与对照组相比，DfGNOM相对表达量显著上调。在拟南芥中也发现了类似现象，可能是由于GNOM蛋白质激活ARF-GTP酶来招募提供抗寒胁迫的效应蛋白，同时调节细胞内生长素的稳态来增强拟南芥的抗寒性[5]。在水稻中，GNOM的过表达显著提高了水稻的耐冷性，而GNOM的下调导致了水稻对冷害的敏感性[34]。在干旱和NaCl处理下，DfGNOM的相对表达量总体上呈上升趋势，但在干旱处理下与对照组相比有显著差异，说明DfGNOM基因可能对干旱胁迫比较敏感，受渗透胁迫诱导[35]。这与小麦GNOM在干旱胁迫下表达量的变化相似[15]。在高温处理下，DfGNOM的相对表达量也有不同程度的变化。可能是因为香鳞毛蕨本身就是生长在火山周围的岩浆缝隙中[36]，可忍耐高温[37]，独特的生理特性增加了香鳞毛蕨对高温的适应能力，这可能是它在长期进化中自然驯化的结果。这些结果进一步表明该基因可能参与香鳞毛蕨非生物逆境胁迫的调控。DfGNOM基因是否具有及如何参与调控响应香鳞毛蕨抗逆等方面的功能仍需进一步深入研究。

综上所述，DfGNOM响应IAA、ABA、MeJA、ETH以及干旱、高盐、高温、低温8种胁迫处理，且相对表达量均呈不同程度的变化，说明DfGNOM可能参与了抗逆途径，这为后续研究香鳞毛蕨抗逆性以及植物激素信号转导途径的响应机制奠定了基础。