QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法检测牛奶中11种激素类药物残留

陈 娟,李永琴,卜宁霞,马 岩,杨 奇

(宁夏兽药饲料监察所,宁夏银川，750011)

激素类药物对动物生理过程起着重要调节作用，可用于治疗动物疾病，促进动物生长发育、提高产量、增加蛋白沉积等[1]。奶牛在哺乳期会分泌一定量的激素，但养殖者为了加速奶牛发育和延长哺乳期会人为加入外源激素，并通过血液循环在牛乳中积累[2]，牛乳中蓄积的激素药物会对人体健康造成较大危害，如增加生殖系统癌症风险[3-4]、诱发免疫性疾病[5]和影响儿童生长发育等[6]，因此欧盟禁止在动物生产中使用激素药物[7]，我国也在《食品安全国家标准动物性食品中兽药最高残留限量》(GB 31650-2019)和农业农村部第250号公告中分别对限用和禁用的激素类药物做出了相应规定[8-9]。

目前，国内外激素类药物的检测方法主要有高效液相色谱法[10]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[11-12]、液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[13-15]等，HPLC-MS具有样品前处理简单、灵敏度高、特异性强等优势，已经广泛应用于激素类痕量药物残留测定。但针对牛奶中激素检测方法的相关研究较少，且检测药物种类少、覆盖面窄，Liu Kun[10]等建立了牛奶中5种激素的自动在线固相萃取-高效液相色谱联用的检测方法，尤亮亮[13]等利用固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定了牛奶中9种性激素残留。同时《食品安全国家标准 动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱-质谱法》(GB/T 21981-2008)中对激素残留测定的前处理方法繁琐、费时、成本高[16]，不能够满足快节奏、大批量的检测需求。

QuEChERS法是一种快速、简易、廉价、有效、稳定、安全的前处理方法，现已广泛应用于兽药残留检测领域[17]。本研究利用QuEChERS法，通过优化前处理方法，结合超高效液相色谱-串联质谱技术，实现对群勃龙、诺龙、甲基睾酮、睾酮、黄体酮、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、勃地龙、司坦唑醇、美雄酮、丙酸睾酮共11种药物快速、高效的定性定量测定，可为牛奶中激素类药物监控提供技术支撑，保障牛奶质量安全。

1 材料与方法

1.1 仪器 Waters ACQUITY UPLC-Xevo TQ-s micro超高效液相色谱-串联质谱联用仪(美国Waters公司)；AE-205电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；CT15RT高速冷冻离心机(日本HITACHI公司)；氮吹仪(美国Organomation Associates公司)；Milli-Q integra 5超纯水仪(美国Millipore公司)；多管涡旋振荡器(安简(北京)科技有限公司)。

1.2 试剂与材料

1.2.1 标准品 群勃龙、诺龙、甲基睾酮、睾酮、黄体酮、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、勃地龙、司坦唑醇、美雄酮、丙酸睾酮药物标照品(纯度≥95 %，除苯丙酸诺龙来源于中国食品药品检定研究院、美雄酮来源于上海安谱公司外，其他标准品均来源于德国Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2.2 材料 Cleaner MAS-Q 净化管(天津博纳艾杰尔有限公司)；乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；乙酸乙酯(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；甲酸(质谱纯，美国Fisher公司)；所用水为超纯水。

1.3 UPLC-MS/MS分析条件

1.3.1 色谱条件 色谱柱为美国 Waters BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相A相为乙腈，B相为0.1 %甲酸水溶液；流速为0.3 mL/min；柱温为40 ℃；进样量为2 μL。流动相梯度见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

1.3.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压：1.0 kV；源温：150 ℃；脱溶剂气温度：500 ℃；雾化气流速：1000 L/h；锥孔气流速：50 L/h。11种激素类药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 11种待测药物质谱条件

1.4 实验方法

1.4.1 样品提取 准确称取混匀后的牛奶样品(2±0.05) g，置于50 mL塑料离心管内，加入乙酸乙酯10 mL，旋涡提取5 min，10000 r/min离心5 min，取上清液于15 mL具塞玻璃试管中，45 ℃氮气吹至近干。残留物用2 mL0.1 %甲酸乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1)溶解。

1.4.2 样品净化 取上清液1.5 mL至Cleanert MAS-Q净化管中，涡旋振荡1 min，10000 r/ min离心5 min，取上清液过微孔滤膜后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4.3 标准溶液的配制 标准储备液配制：分别精密称取11种激素类药物对照品各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配置成浓度为1 mg/mL的标准储备液，-20 ℃可保存6个月。标准工作液：分别准确吸取标准储备液适量，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成适宜浓度的混合标准工作液。

1.4.4 标准曲线绘制 准确吸取混合标准工作液适量，用空白样品提取液配成浓度为0.5、1.0、2.0、5.0、10、50、100 ng/mL的基质匹配混合标准工作溶液，从低浓度到高浓度测定，每一浓度进样3针，以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2 结果与分析

2.1 线性关系 精密量取标准工作液适量，用空白基质稀释成含各药物浓度分别为0.5、1、2、5、10、50、100 ng/mL的系列混合标准工作液，充分混匀，过微孔滤膜，作为基质匹配标准溶液上机测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标(y)，基质匹配标准溶液浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，拟合回归方程。图1为0.5～100 ng/mL基质匹配标准溶液标准曲线图，11种激素类药物的回归方程及相关系数r见表3，由表3可以看出，11种药物在0.5～100 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，r均大于0.998。

图1 基质匹配标准溶液标准曲线图(0.5～100 ng/mL)

表3 11种激素类药物线性回归方程及相关系数

2.2 定量限 添加适量100 ng/mL混合标准溶液于2 g空白牛奶中，前处理后测定，依据各工作溶液对应峰的信噪比S/N>10(按PtP算)，确定出激素类药物的定量限为1 μg/kg。

2.3 方法精密度与准确度 在空白牛奶中分别添加适量标准溶液，制成1、2、10 μg/kg三个不同浓度的空白添加试样，每批次同一浓度做5次平行试验，重复3次，进行回收率试验。试验结果见表4，由表4可以看出，空白牛奶中添加11种激素类药物添加回收率均在60.3 %～119.6 %；批内相对标准偏差在1.7 %～10.9 %；批间相对标准偏差在0.2 %～12.1 %，完全符合我国关于兽药残留检测试验技术规范的要求[23]。1 ng/mL空白牛奶基质匹配标准溶液中11种激素类药物特征离子质量色谱图见图2。

表4 11种激素类药物的加标回收率和精密度(n=5)

图2 11种激素类药物特征离子质量色谱图(1.0 ng/mL)

3 讨论与结论

3.1 质谱条件的优化 实验采用各药物0.2 μg/mL的标准溶液分别在电喷雾离子源正、负离子模式下，采用流动泵连续进样方式进行全扫描，在多反应监测模式下对质谱条件进行优化。结果发现：这11种激素类药物均在正离子模式下响应强度大，在此基础上选择丰度较强、干扰最少的两个子离子作为定性离子，其中丰度最强的子离子作为定量离子，同时确定出最佳碰撞能量和锥孔电压，具体质谱采集参数见表2。

3.2 提取溶剂的确定 目前，国内外激素类药物残留检测常用的提取溶剂主要为乙腈[10、18]、叔丁基甲醚[19]、乙酸乙酯[20]等。因此，实验采用空白添加法，分别考察了乙酸乙酯、乙腈、1 %甲酸乙腈溶液和叔丁基甲醚作为提取溶剂的提取效率。结果表明：叔丁基甲醚提取效率较低，乙酸乙酯和乙腈提取效率较高，但乙腈易使牛奶中的蛋白质变性、乳化，影响提取效果[21]，且作为提取剂也会将牛奶中的水分也提出，降低氮吹浓缩速度，因此选择乙酸乙酯为提取溶剂。

3.3 净化方法的确定 QuEChERS净化方式所使用的吸附剂可将样品中的杂质、有机成分通过吸附、净化作用除去，减小样品基质对提取液中目标化合物的干扰，尤其是高蛋白、高脂肪的牛奶样品。实验采用HLB柱(500 mg/6 mL)、HLB柱(60 mg/3 mL)和Cleaner MAS-Q净化管分别对样品进行净化处理，考察样品净化效果和目标药物回收率。结果发现，三种方法均能起到较好的净化效果，但采用两种HLB柱净化后，丙酸睾酮、丙酸诺龙、苯丙酸诺龙和司坦唑醇4种药物回收率较低(仅为20 %～50 %)，而采用Cleaner MAS-Q净化管净化后，11种药物回收率在60 %～120 %，这可能是因为Cleaner MAS-Q净化管中的吸附剂填料较为丰富，主要有PSA、PC、C18和MgSO4，其中PSA对脂类和糖类的去除效果较好，C18可去除脂类等物质[22]，因此，为保证净化效果和回收率，实验选择Cleaner MAS-Q净化管净化样品，同时此方法还可在净化后直接收集上清液，过滤膜后上机检测，节省传统方法中的固相萃取和浓缩步骤，具有快速、节约、简单的优势。

研究建立了QuEChERS前处理方法结合超高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中11种激素类药物残留的检测方法。样品用乙酸乙酯提取，离心后氮吹浓缩，经0.1 %甲酸50 %乙腈水溶液复溶后用Cleanert MAS-Q净化管净化，过微孔滤膜后供UPLC- MS/MS测定。该方法在优化前处理方式后具有快速、节约、简单的优势，并在0.5～100 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，r均大于0.998。在1～10 μg/kg添加水平下，药物添加回收率均在60.3 %-119.6 %，批内相对标准偏差在1.7%～10.9 %，批间相对标准偏差在0.2 %～12.1 %，定量限为1 μg/kg。该方法简捷、准确、灵敏度高，可满足对牛奶中多种激素药物残留监测的需要。