国产MALDI-TOF MS系统microTyper MS对革兰阴性菌的鉴定性能评估

杨会林，温见翔，闫津津，周丽娜，陈 娟，欧嘉文，黄海灵

北京大学深圳医院检验科，广东深圳 518036

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)利用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，使样品生物分子发生电离并带上电荷，带电荷的生物分子在电场作用下移动，测量移动速度可以得到离子的质荷比，绘制成生物分子质荷比峰图。通过分析不同细菌不同的质荷比峰图，可以进行微生物鉴定。质谱鉴定已经成为微生物实验室的常规鉴定手段,相比生化鉴定，质谱鉴定有简便、快速、准确、高通量等优点[1]。目前，临床微生物实验室使用的质谱鉴定系统多为法国生物梅里埃VITEK MS系统和德国布鲁克Bruker Biotyper。天瑞质谱细菌鉴定系统microTyper MS是国内研发的一款质谱细菌鉴定系统，目前对其细菌鉴定性能还缺乏相应的数据评估。本研究拟评估国产MALDI-TOF MS系统microTyper MS对革兰阴性菌的鉴定能力，为今后microTyper MS的临床应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1菌株来源 收集2018年6月至2019年6月北京大学深圳医院临床分离的革兰阴性菌及实验室收藏的革兰阴性菌标准菌株。临床分离革兰阴性菌中肠杆菌科目细菌2 717株，非发酵革兰阴性菌1 536株及其他少见革兰阴性菌256株。标准菌株包括大肠埃希菌ATCC8739、大肠埃希菌ATCC35218、大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、产气克雷伯菌ATCC713048、阴沟肠杆菌ATCC700323、鼠伤寒沙门菌血清型ATCC14028、铜绿假单胞菌ATCC27853、嗜麦芽窄食单胞菌ATCC717666、流感嗜血杆菌ATCC10211/ATCC49247、侵蚀艾肯菌ATCC BAA-1152。

1.2仪器与试剂 microTyper MS(江苏天瑞仪器股份有限公司)，所用数据库为V1.6.0.10版本；VITEK MS系统(法国生物梅里埃公司)，所用数据库为V3.0版本。两个系统细菌鉴定使用试剂均为仪器配套试剂。

1.3方法 临床标本培养分离纯化后，采用VITEK MS系统及microTyper MS鉴定。标准菌株传代后进行同步鉴定。操作及质量控制参照仪器使用说明书及文献[2-3]。当两种系统鉴定结果出现不一致，或均鉴定不出结果时，采用生化方法或16s rDNA测序进行验证。对于不易区分的复合群，如阴沟肠杆菌复合群(阴沟肠杆菌、阿氏肠杆菌、霍氏肠杆菌、路氏肠杆菌等)、鲍曼不动杆菌复合群(鲍曼不动杆菌、皮特不动杆菌、医院不动杆菌、醋酸钙不动杆菌等)、洋葱伯克霍尔德菌复合群(洋葱伯克霍尔德菌、新洋葱伯克霍尔德菌等)、无色杆菌复合群(木糖氧化无色杆菌、反硝化无色杆菌等)、沙门菌群等，如果系统对复合群细菌鉴定到种，且两系统结果不一致，则需要进行验证。

1.4统计学处理 采用Excel2007软件进行数据处理及统计分析。

2 结 果

2.1细菌鉴定总体情况 标准菌株中除鼠伤寒沙门菌外，其余菌株VITEK MS系统及microTyper MS均能准确鉴定到种水平。临床分离菌株共鉴定4 509株革兰阴性菌，159株鉴定结果不一致。以生化鉴定方法和16s rDNA测序验证后，VITEK MS系统准确鉴定4 419株，准确率为98.0%；microTyper MS准确鉴定4 405株，准确率为97.7%。

2.2肠杆菌目细菌鉴定情况 VITEK MS系统主要对部分柠檬酸杆菌属(12/65)和变形杆菌属(2/94)不能进行属内区分，对部分埃希菌属(3/1 018)、克雷伯菌属(3/1 172)、柠檬酸杆菌属(3/65)鉴定无结果或鉴定错误；而microTyper MS对部分埃希菌属(4/1 018)、克雷伯菌属(7/1 172)、变形杆菌属(4/94)、柠檬酸杆菌属(3/65)、多源杆菌属(4/17)鉴定无结果或鉴定错误。见表1。

表1 肠杆菌目细菌鉴定结果(n)

2.3非发酵革兰阴性菌鉴定情况 对非发酵革兰阴性菌，VITEK MS系统对部分莫拉菌属(3/63)只能鉴定到属，对部分假单胞菌属(9/603)、不动杆菌属(22/546)、伯克霍尔德菌属(3/30)、代尔夫特菌属(6/16)、金黄杆菌属(2/13)鉴定无结果或鉴定错误；而microTyper MS对部分假单胞菌属(20/603)、伯克霍尔德菌属(2/30)、无色杆菌属(3/19)、金黄杆菌属(2/13)鉴定无结果或鉴定错误。见表2。

表2 非发酵革兰阴性菌鉴定结果(n)

2.4少见革兰阴性菌鉴定情况 对少见革兰阴性菌，VITEK MS系统对部分嗜血杆菌属(2/218)、全部气单胞菌属(15/15)只能鉴定到属，对部分嗜血杆菌属(1/218)、全部布鲁菌属(4/4)未给出鉴定结果；而microTyper MS对全部气单胞菌属(15/15)只能鉴定到属，对部分嗜血杆菌属(29/218)、艾肯菌属(3/7)、弧菌属(1/3)鉴定错误。见表3。部分送16s rDNA测序菌株结果见表4。

表3 少见革兰阴性菌鉴定结果(n)

表4 部分两个系统鉴定结果不一致菌株送16s rDNA测序结果

3 讨 论

MALDI-TOF MS通过分析细菌核糖体蛋白谱差异，进行微生物菌种鉴定，在常见细菌和真菌鉴定方面，其鉴定能力不弱于生化鉴定[4]。对于很多不常见微生物，MALDI-TOF MS鉴定能力甚至优于生化鉴定[5]，相比生化鉴定，其鉴定更加简便、快速，较传统的生化鉴定早1～2 d得到鉴定结果[6-7]，临床可以提前根据本地区细菌耐药趋势，做出诊疗调整，节省治疗费用，减少因不合理使用抗菌药物导致的细菌耐药。MALDI-TOF MS除了细菌鉴定，还能用于细菌药敏试验、流行病学调查、蛋白质检测、核酸检测等，具有广阔应用前景[8-11]。目前，国内临床微生物实验室使用的质谱细菌鉴定系统多为进口质谱系统，其具有较完善的数据库，但因病原微生物流行情况存在地域分布差异，需要验证其对国内细菌的鉴定性能。随着我国科技的发展，研制出多款国产质谱细菌鉴定系统[12]。国产质谱系统数据库的构建基于国内流行细菌的蛋白谱，相比进口设备，在国内细菌鉴定方面具有一定优势。但国产质谱系统因起步较晚，在数据库方面还需进一步完善，在临床微生物实验室使用较少，细菌鉴定能力还需进一步验证。

革兰阴性菌是国内临床微生物实验室分离的主要病原菌，占70%左右[13]，设备能否准确鉴定革兰阴性菌，对该设备是否能应用到临床细菌鉴定具有重要参考价值。本研究结果显示，在鉴定准确率方面，microTyper MS与VITEK MS系统在革兰阴性菌鉴定方面具有相近的准确率(VITEK MS系统准确率为98.0%，microTyper MS准确率为97.7%)。VITEK MS系统对部分柠檬酸杆菌属、全部气单胞菌属、部分莫拉菌属只能鉴定到属，对部分不动杆菌属、假单胞菌属、代尔夫特菌属无鉴定结果，而microTyper MS对气单胞菌属只能鉴定到属，对部分变形杆菌属、多源杆菌属、假单胞菌属、无色杆菌属有较多鉴定错误。两种系统对传统不易区分的复合群如阴沟肠杆菌复合群、鲍曼不动杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、无色杆菌属复合群、沙门菌群等，大部分不能鉴定到属，对上述细菌的鉴定能力还有待加强。本研究显示，与进口质谱鉴定系统VITEK MS系统相比，microTyper MS对革兰阴性菌具有相似的鉴定能力。对部分革兰阴性菌如金黄杆菌属、布鲁菌属、艾肯菌属、弧菌属、二氧化碳噬纤维菌属，因临床少见，故纳入比对菌株较少，对这些细菌的鉴定能力，还需进一步验证。革兰阴性菌是国内临床微生物实验室检出的主要病原菌。本研究结果显示，对革兰阴性菌，国产质谱鉴定系统microTyper MS具有与进口质谱鉴定系统VITEK MS系统相似的鉴定准确率。对一些少见革兰阴性菌，还需用更多菌株来验证国产质谱系统的鉴定性能。