华蟾毒它灵降低ARF6蛋白的表达抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖*

刘智慧，张 蓓

1.南京中医药大学，江苏南京 210023；2.徐州市中心医院妇产科，江苏徐州 221000

卵巢癌是一种相对罕见但病死率较高的妇科恶性肿瘤，70%的卵巢癌患者就诊时已处于临床晚期。虽然大多数患者经过初始治疗可获得临床缓解，但仍有70%的患者在3年内复发，5年生存率不足50%[1-3]。二磷酸腺苷核糖基化因子6(ARF6)蛋白与肿瘤细胞的增殖、侵袭等多种生物学行为和患者预后情况密切相关，因而，ARF6蛋白被认为是一种具有潜在应用价值的肿瘤诊断及预后评价因子[4-5]。有研究发现，在子宫内膜癌组织中ARF6蛋白高表达，且与患者预后相关[6]，但ARF6蛋白在卵巢癌中的表达及对患者预后的评价作用尚不完全清楚。华蟾毒它灵(CINO)是从中药蟾酥中提取的丁二烯内酯,由蟾酥制成的中成药，如华蟾素注射液、华蟾素胶囊等对卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌均有较好疗效[7-8]。国外文献报道，超过0.5 μmol/L的CINO可抑制人卵巢癌细胞SKOV3、CRL1978和CRL11731的增殖、迁移和侵袭[9]，但其可能的作用机制，国内外报道较少。本研究拟研究CINO抑制人卵巢癌细胞SKOV3增殖的可能机制，以期为CINO用于卵巢癌治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2015年1月至2017年12月于徐州市中心医院确诊的45例新发卵巢癌患者纳入癌症组，均为接受手术治疗并完成标准化疗的浆液性卵巢癌患者，排除合并其他恶性肿瘤、严重心脑血管疾病、免疫疾病及失访患者，年龄26～81岁，中位年龄54岁。选取因其他生殖器官病变接受手术的45例非卵巢癌患者纳入对照组，均为因子宫肌瘤、腺肌症、宫颈病变行子宫附件切除术的患者，年龄19～83岁，中位年龄51岁。两组研究对象年龄比较，差异无统计学意义(P=0.281)。本研究经徐州市中心医院医学伦理委员会批准后开展，所有患者自愿参与本研究，并签署知情同意书。

1.2仪器与试剂 人卵巢癌细胞 SKOV3 由徐州医科大学中心实验室提供。ARF6蛋白多克隆抗体购自Thermo Fisher公司，批号PA5-44191；兔超敏两步法免疫组化检测试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，批号PV-9001；McCoy′s 5a培养基购自Thermo Fisher公司，批号12330031；胎牛血清购自Hyclone 公司，批号SH30396.03；CINO购自Med Chem Express公司，批号1108-68-5；二 甲 基 亚 砜 (DMSO)购自Aladdin 公司，批号D103277；二喹啉甲酸(BCA)蛋白水平检测试剂盒购自Beyotime 公司，批号 P0010；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购自Beyotime公司，批号P0012A；ECL底物液购自南京聚康医药化工有限公司，批号WBKLS0050。CO2培养箱、超净工作台、MD Spectramac M3多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司，Power Supplies Basic电泳仪购自美国 Bio-Rad公司，Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统170-4150购自美国 Bio-Rad 公司。

1.3方法

1.3.1免疫组化染色检测 所有手术切除标本固定完善，并进行石蜡包埋，制作成4 μm的连续组织切片。严格按免疫组化染色检测试剂盒说明书配制成1∶100的ARF6蛋白抗体，检测组织切片中ARF6蛋白。每张切片均在高倍镜(×400)下随机选取10个视野进行阅片。以>10%癌细胞细胞质呈棕黄色染色为ARF6蛋白阳性的判断标准，否则判定为阴性。以超过50%以上视野的判定结果为最终染色判断结果。

1.3.2细胞培养 将人卵巢癌细胞SKOV3置于含双抗及10%胎牛血清的McCoy′s 5a培养基中，在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将CINO溶于DMSO中，设置0、0.5、1.0、2.0 μmol/L 4组药物处理人卵巢癌细胞SKOV3 48 h，取对数生长期细胞用于实验。

1.3.3蛋白质免疫印迹法检测 用适量胰蛋白酶消化液消化细胞后，将其移至离心管中，加入配制好的冷裂解缓冲液振荡离心取上清液，蛋白定量用BCA法。SDS-PAGE凝胶电泳后电转1 h，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，摇床振荡1.5～2.0 h，加入一抗(1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤3次后，加入二抗(1∶8 000)，常温孵育1 h，TBST洗涤3次后加入ECL显色液于暗室中曝光，荧光采集图像并分析。

1.3.4随访 随访所有患者至2020年12月30日，分析患者生存情况。

2 结 果

2.1卵巢癌组织与正常卵巢组织中ARF6蛋白表达差异 免疫组化检测结果显示，ARF6蛋白表达于细胞质中，卵巢癌组织中ARF6蛋白的阳性表达率为53.33%(24/45)，而正常卵巢组织中ARF6蛋白的阳性表达率仅为15.56%(7/45)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。进一步分析卵巢癌的病理分级发现，低分化卵巢癌组织ARF6蛋白阳性率为61.10%，中高分化卵巢癌组织ARF6蛋白阳性率为48.10%，差异无统计学意义(P=0.393)。

注：A为卵巢癌组织中ARF6蛋白阳性表达；B为卵巢癌组织中ARF6蛋白阴性表达；C为正常卵巢组织中ARF6蛋白阴性表达。图1 不同卵巢组织中ARF6蛋白的表达(×200)

2.2ARF6蛋白的表达与卵巢癌患者预后的关系 45例浆液性卵巢癌患者中，存活21例，死于肿瘤24例，3年生存率为53.33%。Kaplan-Meier生存分析显示，ARF6蛋白阳性表达患者的生存率低于ARF6蛋白阴性表达患者，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 不同ARF6蛋白表达情况患者的生存率分析

2.3不同水平CINO对人卵巢癌细胞SKOV3中ARF6蛋白表达的影响 采用0、0.5、1.0、2.0 μmol/L的CINO分别作用于人卵巢癌细胞SKOV3，各组细胞中ARF6蛋白的相对表达水平分别为0.75±0.42、0.57±0.23、0.42±0.03、0.07±0.01，ARF6蛋白表达水平随药物水平增加而降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 不同水平CINO对人卵巢癌细胞SKOV3中ARF6蛋白表达的影响

3 讨 论

蟾酥是由蟾蜍科中华大蟾蜍的干燥表皮和腺体分泌物提取，一直被认为是具有解毒、消肿、止痛等功能的中药成分。蟾酥具有明显抑制肿瘤的作用，CINO作为蟾酥中的活性成分，其抗肿瘤活性也是近年来的研究热点[10]。EMAM等[11]分析了CINO对人淋巴瘤U937细胞和HeLa细胞的作用，发现CINO诱导了胱天蛋白酶依赖性凋亡，其研究初步揭示了CINO对细胞凋亡信号传导的内在和外在途径。在固有途径中，CINO导致基质金属蛋白酶(MMP)下降，同时释放细胞色素c和激活caspase-3，导致DNA片段化和细胞死亡。在外源性途径中，CINO引起了跨膜蛋白FAS的上调，从而启动了细胞内信号级联反应，导致了死亡诱导信号复合物(DISC)的形成。DISC激活procaspase-8，导致caspase-3激活，随后DNA断裂，细胞死亡。

从药用动植物中提取的化合物已成为前沿医学研究热点，这些化合物显示出抗氧化、抗炎、抗增殖和诱导细胞凋亡的特性，可以使癌症患者获益[12-13]。CINO影响不同的癌细胞信号传导，可能是卵巢癌的潜在治疗药物。

本研究结果表明，ARF6蛋白在浆液性卵巢癌中高表达，在不同病理分级卵巢癌组织中无明显差异，但和患者的预后息息相关，ARF6蛋白高表达患者的预后情况较差。中药成分CINO可以下调人卵巢癌细胞SKOV3中ARF6蛋白的表达。因此，笔者提出一种猜想：CINO抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖可能与其下调ARF6蛋白的表达有关。CINO是目前市面上广泛用于癌症的中药成分，了解其作用机制对于抗癌及抑癌药物的研发非常重要，但更为详细的调节机制有待进一步探讨。

由于组织标本库的局限性，本研究仅选取浆液性卵巢癌进行研究，更多病理类型卵巢癌及更大样本的卵巢癌研究数据尚需进一步探索。