SIRT1在腮腺腺淋巴瘤、多形性腺瘤、鳞癌中的表达分析

李 成，李佳琪，马文哲，郝艳梅，赵桂治，张艺林，张 庆

腮腺肿瘤是口腔颌面部最常见的唾液腺肿瘤,其病理类型复杂，生物学行为多样。由于发病机制尚未明了，对其生物学行为和肿瘤患者的预后亦缺乏理想的判断指标。沉默调节蛋白1(SIRT1)是一种具有高度的保守性，从古细菌到哺乳动物都存在。既往研究，SIRT1对细胞的生存、凋亡、衰老等生理活动起着十分重要的调节作用[1]；近年来研究发现，SIRT1表达水平与多种恶性肿瘤的发生密切相关[2- 3]，但在腮腺肿瘤中的表达及相关意义尚无研究报道。本文旨在比较SIRT1在不同病理分级的腮腺肿瘤组织中的表达水平及意义,为腮腺肿瘤的分子靶向治疗提供新的思路及依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料：标本来源于2017年7月-2019年12月宁夏回族自治区人民医院行颌面外科术并经病理切片证实为腮腺肿瘤的患者。术中取材均分成一式两份：一份样本送病检，石蜡包埋，标本制片，免疫组化检测备用；一份样立刻放入液氮，并置于-80 ℃冻存，用于Real-time PCR检测。所有患者均为初治患者，取材前无其他头颈部肿瘤史、无放化疗及生物学治疗史。

1.2 病例分组：病例样本根据病理类型分为4组，即：A组为良性组19例，B组为交界性肿瘤组22例，C组为恶性肿瘤组18例，D组为癌旁组织组18例。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学检测:石蜡切片标本经二甲苯、乙醇梯度脱蜡至水、内源性过氧化物酶阻断，抗原修复缓冲液中进行高温抗原修复；冷却后山羊血清封闭，SIRT1抗体(Abcam美国，1∶500)孵育过夜，二抗(HRP标记兔抗鼠IgG，碧云天生物公司，1∶1 000)室温孵育1 h,DAB显色，复染，封片，显微镜下观察并记录。免疫组织化学染色阳性为棕黄色或褐色，在高倍镜下观察，根据染色强度和阳性细胞数计分之和进行判断：阳性细胞数占比为0计0分，为阴性；1%～33%计1分，为弱阳性；34%～66%计2分，为阳性；67%～100%计3分高表达，为强阳性。用PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照片制备。

1.3.2 荧光定量PCR检测：取出-80 ℃的冻存组织，锤击破碎后加入Trizol试剂并进行研磨后，进行酚、仿抽提后沉淀，用无Rnase酶的水溶解总mRNA进行定量，用反转录试剂盒合成cDNA,然后根据下述引物进行荧光定量PCR检测。实验步骤简要如下：分别取2 mg瘤体组织、瘤旁组织击碎后分别加入1 mL Triol (Thermo，美国)，用组织匀浆机打碎混匀后，提取总RNA。取3 μg RNA并按逆转录试剂盒MMLV(Invitrogen，美国)进行逆转录合成cDNA,随后进行Real-time PCR扩增(sybgreen试剂盒，碧云天公司)。PCR反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，反应40个循环。引物序列：Sirt1,上游5′-TGGCAAAGGAGCAGATTAGTAGG-3′,下游 5′-CTGCCACAAGAACTAGAGGATAA-3′;GAPDH,上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.4 统计学方法：应用SPPSS 20.0统计软件,计数资料比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SIRT1在不同类型唾液腺肿瘤中的蛋白表达：SIRT1蛋白主要集中在细胞核内表达，在胞浆中也有少量表达，见图1(封三)与表1。结果显示，癌旁组织中SIRT1表达阳性率16.7%，19例良性肿瘤组织中有6例SIRT1表达呈阳性，阳性表达率31.6%； 22例腮腺交界性肿瘤组织中，8例呈阳性表达，阳性表达率36.3%； 18例腮腺恶性肿瘤组织中，10例呈阳性表达，阳性表达率55.6.%；与正常癌旁正常组织相比，肿瘤组织的SIRT1阳性表达率明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；同时，恶性肿瘤组织中 SIRT1 阳性表达率显著高于良性肿瘤组织，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 SIRT1在不同口腔肿瘤组织中的表达[n(%)]

2.2 SIRT1在不同类型唾液腺肿瘤中的mRNA表达水平：Real-Time PCR结果显示(图2，封三)，恶性肿瘤组的SIRT1表达显著高于癌旁组织(P<0.05)、高于良性肿瘤组(P<0.05)和交界性肿瘤(P<0.05)。交界性肿瘤组的SIRT1表达显著高于癌旁组织(P<0.05)。

3 讨论

众所周知，肿瘤的发生与癌基因的过表达或者抑癌基因的低表达密切相关。SIRT1作为一种依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶,可参与众多的生理及病理过程，包括调控细胞应激反应、代谢、衰老和凋亡，并与肿瘤的发生发展、分期分级及预后密切相关[4- 5]。研究发现SIRT1在多种肿瘤组织中高表达，其中包括卵巢癌、胰腺癌[6]、肝癌[7]、肺癌[ 8]、胃癌以及淋巴瘤[9]等，而SIRT1在乳腺癌和结肠癌中表达情况说法不一[10]。

本研究对59例临床标本利用免疫组化技术检测了不同病理类型腮腺肿瘤中SIRT1 的表达，阳性率依次为腺淋巴瘤32%、腮腺多形性腺瘤37%、腮腺鳞状细胞癌58%。结果提示，SIRT1的表达水平在不同病理特征的腮腺肿瘤组织标本中存在差异，病理分级恶性度越高， SIRT1的表达水平越高(P<0.05)。本研究同时检测了上述不同病理类型腮腺肿瘤中SIRT1 mRNA的差异，结果表明腮腺鳞癌瘤组织SIRT1 mRNA水平明显高于癌旁组织，高于交界性肿瘤组织及良性肿瘤。结果提示，SIRT1 mRNA水平与不同病理类型腮腺肿瘤的发生可能存在一定联系。有研究报道细胞癌基因c-Myc可结合于SIRT1的启动子并诱导其表达，miRNA对SIRT1表达也具有调节作用[11-12],这些说明SIRT1在调节相关基因表达的同时，也收到其它相关基因及调节因素的作用，在腮腺肿瘤的发生、发展中SIRT1如何发挥作用，其具体机制有待进一步深入研究。

本研究对SIRT1在不同病理分级腮腺肿瘤中表达及其临床意义进行了初步探讨，结果提示SIRT1表达水平与恶性腮腺肿瘤转移，尤其淋巴结转移是否有关系，后续将收集恶性多形性腺及腮腺鳞癌淋巴结转移病例及增加样本量进一步分析，为开展分子机制方面的研究及进一步明确腮腺恶性肿瘤淋巴转移是否与SIRT1 表达上调有关，为恶性腮腺肿瘤的治疗提供新的临床途径，并为寻求恶性肿瘤治疗的新靶点提供可能的依据。