枸杞多糖对大鼠视网膜光损伤的保护作用研究

韩树梅,周 亮,王普升

光暴露所产生的光化学性损害导致视网膜组织学改变与视网膜变性类疾病中的萎缩性改变相似[1]。动物实验表明，对实验动物视网膜进行一定程度的连续光照射能够引起视网膜光感受器细胞损伤。视网膜光损伤模型是研究视网膜变性类疾病的良好动物模型[2-3]。本研究通过建立大鼠光损伤动物模型，应用枸杞多糖在不同时间段给大鼠进行灌胃治疗，通过记录各组大鼠闪光视网膜电图(F-ERG)，取材HE染色后应用光镜观察各组大鼠视网膜形态学的改变，测量视网膜外核层(ONL)厚度并进行统计学分析，探讨枸杞多糖对大鼠视网膜光损伤的保护作用及其作用机理，从而为视网膜变性类疾病的预防和治疗提供更多依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料:2020年11月-2021年4月在宁夏医科大学动物中心选择清洁级雄性Sprague-Dawley 大鼠48只，7～8周龄，体重200～250 g。随机分为 4 组:正常对照组、模型组、模型+LBP治疗(MLT)组、模型+LBP保护(MLP)组，NC组、M组每组6只大鼠，MLT组、MLP组每组18只大鼠。光损伤模型造模前均行眼前节检查,排除眼部器质性病变。

1.2 实验仪器及材料:采用RETIport(Roland Consult，德国)视觉电生理系统。

1.3 模型制备:自制光损伤箱,自制6面均装有日光灯管的长、宽、高为1.5 m的光照箱，箱内照度经数字式光度计(上海师范大学)测定为4 180勒克斯,箱内温度控制在22～25 ℃。所有实验用大鼠造模前均在循环光环境下(12 h明以及12 h暗)适应7 d,对照组暗适应36 h[4]。实验组在光照前暗适应36 h后,3%戊巴比妥溶液腹腔麻醉,以1%阿托品眼用凝胶滴眼散瞳，缝线开睑,3只放入一个鼠笼(置有饮水设施)，待大白鼠清醒后,将鼠笼放入光照箱内,一个光照箱内可放入4只鼠笼，接受12 h持续光照射。光照射完毕后立即拆除眼睑缝线后并送回暗环境下的饲养笼中饲养24 h后,重复以上模型制作过程,总计3次,光照射时间为36 h。

1.4 给药方法

1.4.1 正常对照组：等量生理盐水连续灌胃60 d。

1.4.2 模型组：造模成功后，等量生理盐水连续灌胃60 d。

1.4.3 MLT组：造模成功后，立即给予不同剂量的枸杞多糖[400、600、800 mg/(kg·d )]连续灌胃60 d。

1.4.4 MLP组：在光损伤造模前，应用不同浓度的枸杞多糖溶液[400、600、800 mg/(kg·d)]连续灌胃60 d，在光损伤造模后，立即给予不同浓度的枸杞多糖溶液[400、600、800 mg/(kg·d)]连续灌胃60 d。

1.5 检测指标

1.5.1 闪光视网膜电图记录：光损伤模型造模成功后不同浓度的枸杞多糖溶液连续灌胃60 d后，对实验大鼠按照常规方法记录闪光视网膜电图ERG 5项基本反应。

1.5.1.1 记录参数：暗适应(Photopic)10.0反应、Photopic 0.01反应及Photopic 3.0反应；明适应3.0反应及明适应3.0 flicker 反应；闪光刺激光强为-25 dB(0.009 5 cds/m2),0.476 Hz;通频带 +/-1mV 1～300 Hz。

1.5.1.2 记录方法：取暗适应12 h 的大鼠，称重后使用3%戊巴比妥溶液予以腹腔麻醉，给予复方托吡卡胺滴眼液(美多丽)散瞳，5 min 1次，点3次，盐酸奥布卡因滴眼液(丙美卡因)进行角膜表面麻醉。记录电极为自制的直径为3 mm的环形银电极，固定于左眼角膜缘，应用1.5号针灸针制作的参考电极及接地电极，分别置于大鼠尾部皮下及被检测眼的同侧颊部。同法做右眼。进行暗适应ERG记录。暗适应 ERG做完后，将实验大鼠明适应10 min以后，再进行明适应3.0反应及明适应3.0 flicker 反应ERG的记录[5]。

1.5.2 视网膜形态学观察：ERG记录后即摘取各组小鼠的右眼球,NC组、M组各6只，MLP组、MLT组各18只，每眼于角膜12：00角巩膜缘处缝线定位标记,沿角膜缘环形切开眼球，去除玻璃体，甲醛固定带有视网膜组织的这一部分眼球、逐级酒精脱水、石蜡包埋,平行于标记处至6点位的平面进行切片，固定距离视神经200 μm截面的切片进行 HE 染色，切片厚度约为5 μm,HE染色后应用光镜进行形态学观察。每个蜡块的1个眼球从视神经向两侧每间隔20 μm做1次切片，每个蜡块取3张切片的测量平均值作为1个样本。测量视网膜外核层(ONL)的厚度[6]。

2 结果

2.1 SD大鼠闪光视网膜电图:造模组、MLT组、MLP组暗适应10.0的a波、b波的幅值较正常对照组均明显降低，b波幅值比较差异有统计学意义(P<0.05)；MLT组、MLP组b波幅值与模型组相比较高，差异有统计学意义(P<0.05)；暗适应10.0 MLT组的b波幅值与MLP组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；暗适应0.01造模组、MLT组、MLP组b波的幅值较正常对照组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；MLT组、MLP组b波幅值与模型组相比较高，差异有统计学意义(P<0.05);暗适应0.01 MLT组的b波幅值与MLP组相比差异无统计学意义(P>0.05)。暗适应3.0反应，M组、MLT组、MLP组的b波波峰延迟出现，b波幅值与正常对照组对比均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；MLT组、MLP组b波幅值与模型组比较高，差异有统计学意义(P<0.05)；MLP组的b波幅值与MLT组比较，差异无统计学意义(P>0.05)；造模组明适应3.0反应及3.0 flicker 反应波形未能完全引出，MLT组、MLP组明适应3.0反应的a波及b波幅值降低，b波幅值较正常对照组低，差异有统计学意义(P<0.05)；MLP组b波幅值与MLT组相比较高，差异有统计学意义(P<0.05)；MLT组、MLP组3.0 flicker 反应的P1波幅值较正常对照组降低，具有统计学意义(P<0.05)。MLT组3.0 flickerP1波幅值与MLP组相比较低，差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 4组大鼠暗适应10.0、0.01、3.0 、明适应3.0 b波及3.0 flicker p1波幅值比较

2.2 视网膜组织学改变:光镜下正常对照组大鼠视网膜 HE 染色后各层组织结构清晰、完整，染色均匀，清晰可见由内向外依次为神经节细胞层(GCL)、内丛状层(IPL)、内核层(INL)以及外核层(ONL)，在内核层和外核层之间的一淡粉色着色的窄带是外丛状层(OPL)。神经节细胞呈单层排列，呈圆形或椭圆形，细胞大小不一；内核层及外核层的细胞呈多层分布，细胞核密集分布，外核层的细胞核层更多、更密集 。根据实验设计，光损伤诱导光感受器细胞变性凋亡、视网膜萎缩的情况，我们成功制成大鼠光损伤视网膜变性模型，取材固定、包埋HE染色后，从形态学角度分析光感受器细胞(视锥细胞和视杆细胞)的存活情况，光镜下观察视网膜结构，分析视网膜内层、外层结构层次的变化，可见造模组光感受器细胞减少，外核层变薄，且视细胞内节(IS)和外节(OS)结构紊乱，IS/OS层变薄。模型组GCL减少，部分细胞核结构未见，核固缩浓染，以内核层和外核层损伤最为明显，内核层和外核层明显变薄，内核层是由水平细胞，无长突细胞，双极细胞的细胞核构成，MLP、MLT组ONL损伤较模型组有所好转，见图1(目录后)。

2.3 各组大鼠视网膜外核层厚度的柱形图分析与比较:模型组、MLT组、MLP组较正常对照组的视网膜外核层厚度均明显变薄，差异有统计学意义(P<0.05)；MLT组、MLP组与模型组比较，视网膜外核层厚度大，差异有统计学意义(P<0.05);MLP组与MLT组比较，视网膜外核层厚度大，差异有统计学意义(F=26.56，P<0.05)，见表2。

表2 4组大鼠视网膜ONL厚度比较

3 讨论

由光污染造成的视网膜光损伤也越来越普遍，如激光损伤黄斑区光感受器、电焊工人的视网膜受损以及长时间熬夜玩手机等均可引起视力下降。光损伤会导致视网膜光感器细胞不同程度的受损，形成视网膜光损伤，临床表现为在黄斑OCT可见中心凹处IS/OS光带的结构紊乱、水肿，甚至是断裂；光感受器细胞(视锥细胞和视杆细胞)的内侧部分核周体形成外核层，外侧部分核周体构成视锥细胞和视杆细胞的内节(IS)和外节(OS)[7]。2018年全国爱眼日的主题是“关注眼健康，预防光污染”，目前各类电子产品的大量使用，不同波长的激光广泛应用于科学领域，家庭中各类装饰灯具以及商场中的各式各样的灯具都是光污染的来源，这一问题不仅是医学界的难题，也成为严峻的社会问题，光污染这个话题越来越受到眼科医生的重视。

枸杞多糖是从宁夏的特色植物枸杞中分离出的主要多糖之一。大量文献报道，枸杞多糖具有抗辐射、防衰老、抗氧化等多种生物学活性，尤其是急性高眼压对视网膜的损伤、糖尿病视网膜病变等疾病具有保护作用[8-9]。在《本草纲目》里枸杞有明目的记载，但其机制尚不清楚。本研究通过建立大鼠光损伤动物模型来研究枸杞多糖对视网膜光损伤的保护作用及其作用机理，结果发现大鼠视网膜通过长时间的日光灯照射后，视网膜的神经细胞层薄变，部分神经细胞胞浆空泡状、液化，部分细胞核固缩、溶解，视网膜的内核层变薄，外层视网膜结构当中的外核层及IS/OS层均有不同程度的薄变；视电生理的结果显示，光损伤模型后，造模组暗适应10.0、0.01、3.0反应中的b波幅值较正常对照组均明显降低，差异具有统计学意义。应用枸杞多糖进行干预后MLT组及MLP组暗适应10.0、0.01、3.0反应中的b波幅值较正常对照组是降低的，但较造模组有好转；明适应3.0反应及3.0 flicker反应波形造模组未能完全引出，MLT组、MLP组明适应3.0反应的a波及b波幅值降低，波峰延迟出现，3.0 flicker 反应的N1及P1波幅值降低，与正常对照组比较b波幅值高，差异具有显著性，说明视网膜光损伤后应用枸杞多糖治疗有效，视网膜功能有不同程度的恢复。造模组、MLT组、MLP组3组视网膜电图暗适应10.0、0.01、3.0反应中反应波幅值均降低，波峰延迟出现；造模组明适应3.0反应及3.0 flicker 反应波形未能完全引出，这表明了光损伤模型的成功及视网膜光损伤的确定性。视电生理的各项视网膜电图作为评判视网膜功能的主要检查手段[5]，已经被广泛应用于动物实验当中，从此项研究视网膜电图的结果分析可发现在大鼠视网膜光损伤模型中，大鼠的视网膜功能严重受损，应用枸杞多糖干预治疗的MLT组、MLP组的各项闪光视网膜电图结果较造模组要好，同时造模前后均使用枸杞多糖干预的MLP组在明适应3.0及3.0 flicker反应波形幅值的降低程度较单纯造模后应用枸杞多糖的MLP组要低，差异有统计学意义，但是在暗适应10.0、0.01、3.0中未见明显差异，提示枸杞多糖对视杆细胞的修护作用强于视锥细胞，还需要进一步研究。病理学检查结果显示，MLT组、MLP组视网膜外核层的厚度较正常对照组依然是下降的，但较造模组要高，差异有统计意义(P<0.05)。MLP组视网膜外核层的厚度较MLT组明显增高的，差异有统计意义(P<0.05)，这与视电生理检查结果相符，表明同时在光损伤前提早进行枸杞多糖干预治疗，更有利于预防、保护视网膜受损以及加强视网膜受损伤后的修护。

本研究结果提示，光污染会严重影响视网膜的代谢，可造成视网膜IS/OS带结构的紊乱、水肿，甚至是断裂，严重影响视力。具有一定强度的可见光长时间的照射眼睛，依然会影响到视网膜的代谢，视网膜光感受器细胞凋亡，视网膜外层甚至是全层的变薄；而枸杞多糖可以保护和治疗视网膜光损伤，减少视网膜光感受器的凋亡，在视网膜光损伤前，提早用枸杞多糖的干预比单纯光损伤后的应用效果更好，这就为视网膜光损伤以及视网膜变性类疾病的治疗提供了一定依据。