利用基因打靶技术构建血管内皮特异性Stk24/25双基因敲除小鼠

高睿，郑祥建

（天津医科大学基础医学院药理学系，天津 300070）

生发中心激酶Ⅲ（GCKⅢ）是Sterile 20家族蛋白亚群，包括STK24、STK25、MST4。它们在控制细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移及黏附等过程中发挥重要作用。近几年，GCKⅢ复合物被报道与很多临床疾病相关，包括海绵状脑血管畸形（CCM）[1]。CCM是较为常见的脑血管疾病，可引起卒中、头痛、癫痫、脑出血，其致病基因为CCM1、CCM2、CCM3。在结构上，CCM3通过其N-末端二聚化结构域结合GCKⅢ，并且招募其他CCM相关基因（CCM2、CCM1）形成完整的复合体，在CCM病理生理中起到不可或缺的作用[2-3]。STK24、STK25、MST4是CCM致病基因的下游，在斑马鱼模型中敲除Stk24和Stk25基因后会引起与CCM3相似的心血管表型[4-5]。本研究致力于构建血管内皮特异性Stk24和Stk25双基因敲除小鼠，为Stk24、Stk25基因敲除小鼠作为CCM疾病模型，进一步探讨CCM致病通路提供坚实基础。

1 材料及方法

1.1 实验动物Cdh5creErt2工具鼠来自Ralf Adams实验室，Stk24fl/fl小鼠由上海模式生物科技公司定制，Stk25fl/fl小鼠由本实验室构建制备。实验过程中对小鼠的处置按照中华人民共和国科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》相关规定进行，符合动物伦理学管理要求。伦理批号：2017022501。

小鼠的饲养繁殖均在天津医科大学实验动物中心SPF级动物房中。屏障内环境均符合国家对实验动物环境设施的要求，温度：20℃～26℃；相对湿度：40%～70%；12 h/12 h循环光照；垫料、笼器具均进行高压真空灭菌，达到纯净无菌要求，动物采用自由饮水进食的方式；鼠笼的垫料隔天更换1次，保证小鼠居住环境的洁净度。

1.2 主要试剂TRIzolTM试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司），2X GoTaq master Mix（Promega），琼脂糖（北京索莱宝科技有限公司），DNA分子量标准指示剂（思科捷），实时定量qPCR mix（Genstar），cDNA逆转录试剂盒（genstar）血管内皮特异磁珠（Miltenyi），胶原酶Ⅳ（sigma公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 基因打靶构建基因工程小鼠 利用基因打靶技术分别构建Stk24、Stk25转基因小鼠。首先在Ensemble基因库分析目标基因Stk24和Stk25。最终选定4号外显子作为Stk24的目标靶点，3、4、5号外显子作为Stk25的目标靶点，并且在3′和5′端适当位置插入loxp位点，如图1所示，由此构建目标基因载体。随后在ES细胞达到指数增长时期时，使用电击法将目标基因载体转到ES细胞中，完成阳性筛选后将阳性克隆注射入小鼠受精卵中，得到F0代基因工程小鼠，如图2。进一步将Stk24、Stk25基因敲除小鼠进行杂交，得到两种基因同步敲除的小鼠。

图1 Stk24以及Stk25打靶基因载体构建示意图Fig 1 Construction of vector of Stk24 and Stk25 target gene

图2 显微注射原理图Fig 2 Schematic diagram of microinjection

1.3.2 小鼠基因型鉴定 以剪掉小鼠脚趾的方式进行编号，随后对小鼠基因型进一步鉴定。将小鼠组织块放入对应编号的1.5 mL EP管内，加入75 μL鼠尾裂解液，离心，确保小鼠组织块已沉入管底，95℃水浴30 min后加入75 μL中和液。随后取2 μL作为DNA模板进行PCR扩增，反应体系以及PCR程序设定如下。反应体系为2 μL DNA模板，正向反向引物各0.5 μL，水3 μL，GOtaq mix 5 μL。PCR仪反应程序如下：预变性：94℃，5 min；变性：94℃，30 s；退火：60℃，30 s；延伸：72℃，40 s。变性，退火，延伸为32个循环；延伸：72℃，10 min。扩增产物用2.5%的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，根据条带长度来鉴定小鼠基因型。鉴定引物详见表1。

表1 小鼠基因型鉴定引物序列Tab 1 DNA identification primer sequences of mice

1.3.3 出生后小鼠诱导基因敲除 在幼鼠出生后第2天使用4-羟基他莫昔芬诱导，确保喂养良好，小鼠幼崽采用侧卧位，左手抓取，暴露出白色奶水充盈的胃部。此时使用1 mL胰岛素注射器经小鼠胃部注射，快速进针，深度约为0.5 cm，剂量为0.025 mg/g。停留30 s左右，慢慢将针移出，用酒精擦去少量溢出的液体，将注射完毕后的小鼠放入母鼠身边，并向笼内加入瓜子安抚母鼠。于出生后第6天检测目的基因诱导敲除情况。

1.3.4 分离小鼠脑血管内皮细胞 将小鼠麻醉后，充分暴露下腔静脉以及心腔，剪断下腔静脉的同时从左心室缓缓注入PBS溶液充分灌流，尽量冲走组织内循环的血液。剖开小鼠颅骨，将小脑剪碎研磨，并加入配置好的胶原酶Ⅳ在37℃水浴使组织充分消化，离心重悬过70 μmol/L筛，重悬后与血管内皮特异性磁珠在4℃进行孵育，利用磁珠的特异性结合作用筛选出小鼠小脑血管内皮细胞。选择将两对对照组小鼠和两对基因敲除小鼠的小脑内皮细胞合并。以上实验共重复5次，产生5组实验数据。

1.3.5 RNA提取 加入Ttizol迅速裂解组织后，静置使细胞充分裂解，加入氯仿，震荡离心后将试管45°倾斜取上清，加入异丙醇混匀孵育后离心，弃掉上清，使用75%乙醇清洗沉淀，离心后，晾干加入适量水溶解。

1.3.6 mRNA水平检测 得到小脑血管内皮细胞RNA后，测定RNA浓度，利用逆转录试剂盒经PCR仪逆转录后得到cDNA，随后进行RT-qPCR，对mRNA表达水平进行分析。引物信息见表2。

表2 RT-qPCR引物Tab 2 RT-qPCR primer sequences

1.5 统计学处理RT-qPCR结果采用Graph Prism软件进行分析。数据呈现正态分布，并采用非配对t检验来确定统计学意义。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠基因型鉴定结果 通过PCR检测loxp位点，Stk24野生型条带位置在200 bp，目的条带在250 bp。Stk25野生型条带位置在300 bp，目的条带在400 bp。Cdh5cre位点为500 bp的阳性条带。因此使用Cdh5cre+/Stk24fl/+/Stk25fl/+雄鼠与Stk24fl/fl/Stk25fl/fl雌鼠杂交，可以初步得到Cdh5cre+/Stk24fl/+/Stk25fl/fl目的小鼠。下一步利用Cdh5cre+/Stk24fl/+/Stk25fl/fl与Stk24fl/fl/Stk25fl/fl进一步杂交，可得到Cdh5cre+/Stk24fl/fl/Stk25fl/fl，见图3。

图3 Stk24、Stk25条件性敲除小鼠基因型鉴定电泳图Fig 3 Electrophoretogram for genotyping of Stk24 and Stk25 conditional knockout mice

2.2 转录水平验证Stk24、Stk25基因敲除 通过对5组实验结果的统计学分析发现，分别与对照组相比，诱导后血管内皮特异性敲除小鼠Stk24和Stk25的敲除效率分别为27%（t=2.84，P=0.0207）和30%（t=17.21，P<0.001），而同为GCKⅢ蛋白家族的Mst4基因表达量差异没有统计学意义。见图4。

图4 小鼠小脑血管内皮细胞中相关基因mRNA表达情况Fig 4 Relative mRNA expression in endothelial cells of cerebellum in mice

3 讨论

CCM是一种显性遗传疾病，患者首发症状通常为癫痫、头痛、反复发作的脑出血，严重影响患者生活质量[6]。近年来，随着对海绵状畸形疾病研究逐渐明朗，研究者发现其致病基因主要由CCM1、CCM2、CCM3基因构成，一般情况下3种基因形成一个完整的复合体，进而对下游丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MEKK）3通路起到抑制作用[7-8]。一旦其中基因发生突变，对MEKK3的抑制作用消失，转而激活MEKK3及其下游基因，使正常血管形态发生改变，出现静脉瘤样病理表现[9]。

有研究报道，CCM3可与Sterile-20样激酶的GCKⅢ亚家族成员结合，在果蝇模型中，GCKⅢ和CCM3基因的缺失对果蝇气管发育具有相同的影响[10]。先前研究发现，在斑马鱼模型中敲除Stk24和Stk25也同样导致斑马鱼心脏变大，心包积液等严重心脏表型，与CCM基因敲除后的表型基本一致[11]。为进一步验证GCKⅢ蛋白家族Stk24和Stk25在哺乳动物体内的作用，笔者利用基因打靶技术构建了Stk24/Stk25双基因敲除小鼠模型。基因敲除小鼠作为疾病研究的重要模型动物，可模拟疾病的发生、发展，在疾病的机制研究中起重要作用。因此构建血管内皮特异性Stk24和Stk25双基因敲除小鼠，对CCM致病通路以及血管发育的研究起到至关重要的作用。本研究成功繁育出目的基因敲除小鼠，并对其进行基因型鉴定以及mRNA水平敲除效率验证，确认成功构建出血管内皮细胞特异性Stk24/Stk25敲除小鼠。通过对基因敲除小鼠的生长繁殖情况进行观察，笔者发现其与野生型小鼠具有相同的繁殖能力，并且子代状态良好。综上，本研究通过基因打靶技术成功构建了Stk24/Stk25双基因敲除小鼠，为进一步研究海绵状脑血管畸形致病机制以及相关药物筛选提供了较好的动物模型。