静松灵对小型猪脑区NO-cGMP信号转导系统的影响

申美伦，张 宇，马相影，张志恒，李柔茜，金箫迪，高 利

(东北农业大学动物医学学院/黑龙江实验动物与比较医学重点实验室，黑龙江哈尔滨 150030)

一氧化氮(nitric oxide，NO)作为一种信号分子，能够在细胞内起到重要作用而被广泛应用。而一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化后可产生NO。NO可激活环磷酸鸟苷(guanosine 3′,5′-cyclic phosphate，cGMP)，能够传递细胞间信号[1]。静松灵作为二甲苯胺噻嗪类似物，是一种α2肾上腺受体激动剂，该药物的麻醉作用对信号转导系统有显著的影响[2]。静松灵在很多种类动物上都能产生明显的镇痛、镇静和麻醉作用。NO/cGMP信号转导系统可使麻醉药对神经产生突触作用，从而产生镇痛和麻醉效果[3-5]。因此，通过研究了解静松灵发挥作用与NO-cGMP信号系统等中枢信号系统之间关系有重要意义。试验设计研究静松灵对小型猪麻醉的主要作用脑区中NO、NOS和cGMP变化，拟从小型猪中枢神经细胞信号转导系统的变化探讨静松灵麻醉作用的分子机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 巴马小型猪20头，8月龄～9月龄，雌雄兼用，体重30 kg±5 kg，健康状态良好。

1.1.2 试验药品与试剂 静松灵原粉(纯度大于99.5%)，东北农业大学动物医学学院外科实验室提供；NOS、NO、考马斯亮蓝蛋白质测定试剂盒，南京建成生物工程研究所产品；猪cGMP测定试剂盒，中国卡尔文生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 Datex-OhmedaS/5TM型重症监护仪，芬兰Datex-Ohmeda公司产品；IntelliVue MP20监护仪，荷兰Philips公司产品；Sigma 3-30K型高速低温离心机，德国Sartorius公司产品；普通离心机，上海安亭科学仪器厂产品；HH数显恒温水浴锅，河南星宇航天航空仪器厂产品；微量移液器，芬兰勃雷公司产品；XW-80A型漩涡振荡器，上海医科大学仪器厂产品；BSA224S型电子天平，Sartorius科学仪器北京有限公司产品；U570-86型超低温冰箱，英格兰New Brunswick Scientific公司产品；DNP-9162型电热恒温培养箱，上海精宏试验设备有限公司产品；BioTek EpochTM超微量微孔板分光光度计，美国伯腾仪器有限公司产品；BioTek ELx50型洗板机，美国伯腾仪器有限公司产品；T6新世纪紫外-可见光分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；手动玻璃匀浆器、电动石膏锯、手术器械等常规仪器。

1.2 方法

1.2.1 试验动物分组 从20头巴马小型猪中随机选取5头注射生理盐水作为对照组(C组)，其他为静松灵组。静松灵组T1、T2、T3时期各5头。肌内注射等量的生理盐水(10 mL)和静松灵(0.25 mL/kg)。

1.2.2 样品的采集与处理 计时并当小型猪注射静松灵后在平稳、深麻醉以及恢复的3种麻醉状态选取合适的时间点处死。本试验选择3个时间点，分别为T1时期的15 min、T2时期的45 min和T3时期的75 min。达到预定时间点后，麻醉后处死小型猪，取脑并用4 ℃生理盐水把脑组织上的血冲洗净，在冰面上立即将大脑皮质、小脑、丘脑、海马和脑干分离后称重记录，置于冻存管后放入液氮中等待测定。

1.2.3 脑组织中指标的测定 按照试剂盒说明测定静松灵对不同脑组织NO含量与NOS活性的影响。cGMP含量也按照ELISA试剂盒说明操作测定。

1.2.4 数据统计分析方法 SPSS 22.0软件进行统计分析，试验结果用平均值±标准差表示；P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 静松灵对小型猪不同脑区NOS活性的影响

如图1所示，相比对照组，其他时期小型猪注射静松灵后各脑区NOS活性大体均呈现下降趋势。在T1平稳时期，小型猪海马中NOS活性受到抑制，差异显著(P<0.05)。相比之下，大脑皮质和脑干中NOS活性受到抑制更明显；在T2深麻醉时期，大脑皮质、海马、丘脑和脑干中NOS活性相比T1时期下降更明显，差异极显著(P<0.01)；而在T3时期，大脑皮质、海马和脑干中NOS活性持续明显下降。仅在丘脑中NOS活性呈现恢复趋势，差异极显著(P<0.01)。在各个时期中，小脑中NOS活性无明显变化。

图1 静松灵对小型猪不同脑区NOS活性影响变化

2.2 静松灵对小型猪不同脑区NO含量的影响

如图2所示，在T1平稳时期，小型猪注射静松灵后大脑皮质NO含量下降极显著(P<0.01)，在海马和丘脑中NO含量也受到明显抑制(P>0.05)；在T2深麻醉时期，大脑皮质中NO呈上升趋势，而与T1时期相比，海马中NO持续下降，差异显著(P<0.05)，丘脑明显持续下降，差异极显著(P<0.01)；在T3恢复时期，大脑皮质、海马和丘脑中NO含量均呈现回升趋势(P>0.05)。在各个时期中，小脑和脑干中NO含量无明显变化。

图2 静松灵对小型猪不同脑区NO含量影响变化

2.3 静松灵对小型猪不同脑区cGMP含量的影响

如图3所示，在T1平稳时期，小型猪注射静松灵后，各脑区中cGMP均呈现出下降趋势，但相比对照组，脑干与海马中的cGMP下降更明显，差异显著(P<0.05)，而与T2时期相比，海马中cGMP明显降低，差异显著(P<0.05)；在T2深麻醉时期，脑干和大脑皮质中cGMP持续保持下降，与对照组相比差异显著(P<0.05)；在T3恢复时期，所有脑区中cGMP均回归初始水平(P>0.05)。在各个时期中，丘脑和小脑中cGMP含量无明显变化。

图3 静松灵对小型猪不同脑区cGMP含量性影响变化

3 讨论

NO-cGMP信号转导系统能够参与多种机体系统功能状态的变化[6]。近些年的一些相关研究表明该系统对突触可塑性、神经递质的释放和摄取、神经元的分化和生长、神经传递、神经炎性反应及部分基因表达等都具有调控作用[7-9]。一氧化氮作为一种细胞内和细胞间递质物质，其在神经元组织在内的多种组织中都能由一氧化氮合酶催化合成。在细胞内，一氧化氮与鸟苷酸环化酶的部分结合，从而增加cGMP的含量。据研究表明，α2肾上腺素受体激活后，全麻药可以通过兴奋受体改变NO-cGMP信号转导系统，从而增加或减少细胞内的cGMP含量[10]。静松灵作为一种α2肾上腺素能受体激动剂，其麻醉作用可能与NO-cGMP信号转导系统有关[11]。麻醉药与NO/cGMP信号转导系统的作用机理有受体水平、NOS或sGC 3种。3种作用机理都能够调控cGMP。cGMP又作为第二信使可使蛋白激酶、磷酸二酯酶和离子通道等结构调节活性。这些结构也可能与静松灵的麻醉作用相关。

在刘焕奇[12]对噻拉唑对大鼠不同脑区cGMP含量的影响研究中，结果表明噻拉唑能明显抑制大鼠大脑皮质、海马和脑干cGMP含量，也说明了麻醉药与cGMP的关系，这与我们的结果基本一致。在文献[13-14]中与本试验比较中发现不同时间段呈现的趋势相似。当小型猪注射静松灵后，在T1平稳期，各脑区的不同组织的活性或含量大体出现了下降趋势。而在T2深麻醉期，随着麻醉时间的增加，除了大脑皮质中NO呈上升趋势外，各脑区的不同组织的活性或含量大体下降更显著。在T3恢复期，除大脑皮质、海马和脑干中NOS活性持续明显下降外，各脑区的不同组织的活性或含量整体恢复到初始水平。这也与巴马小型猪的行为学变化相一致。本试验结果证明，小型猪注射静松灵后，各脑区中不同组织的含量及活性均出现了不同程度的下降趋势。除小脑外，其他脑区NOS明显受到抑制。同时，小型猪中大脑皮质、海马和丘脑3个脑区内NO也发现显著降低，而且大脑皮质、丘脑和脑干3个脑区内的cGMP也明显减少。师铭咸等[15]研究表明咪达唑仑对山羊大脑、海马、丘脑、小脑和脑干内NOS活性、NO含量、cGMP浓度有明显抑制作用，由此对于静松灵麻醉机制的作用其可能是抑制NO-cGMP信号转导系统的结果。影响静松灵麻醉效果有很多种，本文只是针对静松灵和NO-cGMP信号转导系统之间进行研究。单一的全麻药对于小型猪的研究可能还不够，NO/cGMP信号转导系统对于小型猪的麻醉也只是重要的靶点之一。NO/cGMP信号转导系统在小型猪麻醉过程中的作用，对于阐明静松灵的麻醉机制具有重要意义。

本研究证明，小型猪注射静松灵后，主要在大脑皮质、海马、丘脑和脑干中的NOS、NO和cGMP参与了静松灵的麻醉过程，与其麻醉作用能够抑制NO-cGMP信号系统密切相关。