人工感染PRRSV JXA1株仔猪肾脏组织病理变化及病毒分布

吴显平，杨重锦，2，迟盛仁，张志欢，张永红，张 涛*

(1.北京农学院动物科学技术学院兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206；2.北京市神经外科研究所，北京 100070)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是当前严重危害我国和世界养猪业的重要病原之一。研究表明，PRRSV感染仔猪不仅引起其呼吸系统症状和肺脏的损伤[1]，也会引起败血症和淋巴结、脾脏、肾脏、胃脏、小肠等多种器官的明显病理变化[2-3]。尽管通常认为PRRSV对宿主感染具有严格的组织和细胞嗜性[4]，主要靶细胞是肺泡巨噬细胞[5]，但有关病理学检测结果显示，PRRSV病毒粒子在感染仔猪组织器官的分布相当广泛[6]。深入研究PRRSV感染对肺脏以外其他组织器官的影响，有助于更全面和深入地了解其致病机制。

肾脏是动物体的重要排泄器官，机体大部分的代谢产物都要通过肾脏生成的尿液排泄，这也使之更易受到病毒感染。肾脏出血点和坏死点是PRRSV感染仔猪常见的剖检变化[7]，研究PRRSV感染仔猪肾脏组织的病变和病毒粒子分布，对全面了解该病毒的致病性及做好“既病防变”具有重要意义。已有文献虽表明PRRSV病毒粒子在肾脏组织内有分布[6-7]，但对肾脏组织的感染细胞类型尤其是血管内皮细胞鲜有关注。鉴于此，本试验以PRRSV JXA1株感染仔猪肾脏组织制作石蜡切片，深入研究了其病变特征和病毒粒子分布。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 组织样品 肾脏组织样品取自于北京农学院兽医学(中医药)北京市重点实验室前期试验长白仔猪，约5周龄，平均体重约9.3 kg，健康状况良好，试验前经PRRSV抗原检测均呈阴性。分为正常对照组和人工感染组，每组3头仔猪。正常对照组仔猪常规饲养管理，试验期间均无明显临床症状；人工感染组仔猪经滴鼻和肌肉注射途径分别接种1 mL PRRSV JXA1株细胞培养液，接种后4 d～5 d出现明显临床症状，主要表现为体温升高，食欲减少，鼻流清涕，发抖，扎堆，腹泻，偶见呼吸困难，发病3 d后腋静脉放血处死，剖检可见人工感染组仔猪的肾脏淤血和肿大，表面有少量的出血点或出血灶。采取仔猪的肾脏组织投入40 mg/mL多聚甲醛溶液固定，备用。

1.1.2 主要试剂 苏木精染色液(货号C0105-1)、伊红染色液(货号C0105-2)，碧云天生物技术有限公司产品；兔抗PRRSV N蛋白多克隆抗体(货号bs-23941R)、兔抗PRRSV GP5蛋白多克隆抗体(货号bs-4504R)，北京博奥森生物科技有限公司产品；兔SP试剂盒(货号SP-9001)、DAB染色试剂盒(货号ZLI-9017)，北京中杉金桥生物技术有限公司产品；柠檬酸钠抗原修复液(货号C1032)，北京索来宝科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 生物组织石蜡脱水机(ZT-12M)、生物组织石蜡包埋机(YB-6LF)，湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司产品；展片机(ZPJ-1A)，天津天利航空机电有限公司产品；切片机(RM2235)，德国Leica公司产品；倒置荧光数码显微分析系统(IX-71)，日本Olympus公司产品。

1.2 方法

1.2.1 石蜡切片的制备 每头仔猪各取1块经40 mg/mL多聚甲醛溶液固定的肾脏组织，自来水充分漂洗去除固定剂，修剪为厚约0.5 cm、长宽均约1 cm的小块，参照文献[8]中的石蜡切片制作方法，制作5 μm厚的切片，脱蜡后进行HE或免疫组织化学染色。

1.2.2 HE染色 每头猪的肾脏组织取3张已脱蜡的切片，按照常规方法进行HE染色、脱水和透明，中性树胶封片，镜检观察、拍照。

1.2.3 免疫组织化学染色 将脱蜡后的切片置于柠檬酸钠抗原修复液，用微波炉加热进行抗原修复，PBS充分浸洗，按照常规方法，对PRRSV GP5蛋白和N蛋白进行免疫组织化学染色，脱水、透明，中性树胶封片，镜检观察、拍照。

2 结果

2.1 肾脏组织的病理学变化

对石蜡切片的HE染色结果显示，正常对照组仔猪肾脏组织的结构未见异常(图1A和图1C)；人工感染组仔猪肾脏的皮质和髓质均有明显的充血和出血，肾小球和肾小囊肿胀扩张，肾小管和肾间质组织中有大量红细胞，组织间隙变宽，部分肾小管的上皮细胞出现变形和脱落，部分肾小管内可见均质红染的蛋白质管型(图1B和图1D)。

A/C.正常对照组；B/D.人工感染组；标尺=200 μm(A、B)或50 μm(C、D)。无尾箭头示变宽的组织间隙，箭头示炎症细胞，弯箭头示充血，中空箭头示扩张的肾小球和肾小囊，星型示蛋白质管型

2.2 肾脏组织PRRSV GP5蛋白的免疫组织化学染色结果

GP5蛋白是PRRSV主要结构蛋白中的唯一囊膜糖蛋白，是检测PRRSV病毒粒子的常用抗原。对肾脏组织的PRRSV GP5免疫组织化学染色显示，人工感染组仔猪肾脏组织的肾小球毛细血管内皮细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞、肾小囊上皮细胞、肾小管上皮细胞和间质组织，PRRSV GP5蛋白免疫组织化学染色均呈棕黄色阳性着色(图2A和图2C)；正常对照组仔猪肾脏组织无明显的阳性着色(图2B和图2D)。

A/C.正常对照组；B/D.人工感染组；标尺=200 μm(A、B)或50 μm(C、D)

2.3 肾脏组织PRRSV N蛋白的免疫组织化学染色结果

为了进一步验证肾脏组织内病毒粒子的分布及了解不同PRRSV抗原对检测结果的影响，本试验亦对PRRSV N蛋白进行了免疫组织化学染色。结果显示，正常对照组仔猪肾脏组织均无明显的阳性着色(图3A和图3C)；PRRSV N蛋白免疫组织化学染色的着色部位与GP5蛋白类似，在人工感染组仔猪肾脏组织的肾小球毛细血管内皮细胞、肾小管上皮细胞、肾小管周围毛细血管内皮细胞和肾间质组织，均可见阳性着色，而肾小球毛细血管内皮细胞的着色细胞数量较少，着色强度较低(图3B和3D)。

3 讨论

肾脏的肿大和弥散性出血是PRRSV感染仔猪常见的病理变化，显示病毒对肾脏组织产生了明显损伤。本试验通过HE染色检测了人工感染PRRSV JXA1株仔猪肾脏组织病理变化，并且通过免疫组织化学染色检测了其病毒粒子的分布，结果表明，人工感染仔猪肾脏的组织结构发生了多种明显的病理性变化，在血管内皮细胞、肾小管上皮细胞和肾间质等肾脏组织的多种细胞内检测到了病毒抗原的存在。

有关PRRSV感染所致仔猪各组织器官病变及其组织内病毒抗原分布的研究报道并不鲜见[9-11]，但无论自然发病还是人工感染PRRSV的仔猪，均较多关注于肺组织的病理学变化[12-13]，而对肾脏组织的专门性研究报道较少，多为与其他脏器一起的简要描述。另一方面，已有文献[9-11,14]中试验所用的PRRSV毒株虽有所不同、仔猪日龄或品种也有差异，但结果大多表明，感染仔猪的肾脏组织均有明显的充血或出血，这与本试验使用PRRSV JXA1株感染仔猪的试验结果一致，表明引起了肾脏毛细血管的明显损伤和病理变化。PRRSV JXA1株分离自2006年暴发于我国南方部分省份的高致病性PRRSV感染仔猪，用其复制的人工感染仔猪模型，能够更好地反映我国高致病性猪繁殖与呼吸综合征的仔猪临床表现和病理变化，试验结果更有助于我国猪繁殖与呼吸综合征发病机制的阐明。

为了确定PRRSV在感染仔猪肾脏组织内的定位，本试验采用免疫组织化学方法分别检测了GP5蛋白和N蛋白2种病毒抗原。二者均是PRRSV的重要结构蛋白，其中，GP5是PRRSV的一种糖基化囊膜蛋白，N蛋白是含量最为丰富的核衣壳蛋白。PRRSV感染仔猪肾脏组织的病理变化在文献报道中基本一致，而肾脏组织中病毒抗原分布的报道结果却不尽相同。例如，李冰等[9]研究认为，欧洲型PRRSV LNEU12株感染30日龄仔猪，其肾脏和肝脏中的病毒含量仅次于肺脏和淋巴器官。张平英等[6]研究显示，PRRSV SC-I株感染仔猪7 d后，肝脏和脾脏中未检测到病毒抗原，而肺脏和肾脏中的病毒抗原阳性细胞水平近似，且肾脏血管内皮细胞可见阳性着色。Cooper V L等[15]研究则认为，尽管在感染后的任一检测时间点均显示有明显的肾脏血管内皮组织的损伤，但是对病毒抗原的免疫金银染色检测却未发现被PRRSV感染的内皮细胞。本试验通过PRRSV GP5和N蛋白的免疫组织化学染色显示，肾脏组织内肾小球毛细血管和肾小管周围毛细血管的内皮细胞均可见阳性着色。本试验研究结果与张平英等[6]的报道相似，而与Cooper V L等[15]的试验结果不同，其原因是否与所用PRRSV毒株或免疫组织化学检测方法有关，尚需进一步研究。另外，本试验研究显示，PRRSV GP5抗原的免疫组织化学染色对肾脏组织内皮细胞的阳性着色优于N抗原，表明免疫组织化学检测PRRSV的不同抗原对病毒粒子的显示有一定影响。

A/C.正常对照组;B/D.人工感染组;标尺=200 μm(A、B)或50 μm(C、D)

综上所述，本试验结果确证了PRRSV感染会引起严重的肾脏组织损伤，病毒抗原存在于肾血管内皮细胞、肾小管上皮细胞等。血管组织不仅是营养物质和代谢产物的运输通道，血液循环也是病原体向动物各组织脏器扩散的途径。因此，本试验结果提示，肾血管病变和血管内皮细胞感染的研究应是全面阐明PRRSV致病机制不可或缺的内容。