小鼠肺间充质干细胞的分离、培养和鉴定

石桂英黄艺滢雷雪裴路亚岚白 琳

(中国医学科学院医学实验动物研究所,北京协和医学院比较医学中心,国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室,国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室,北京 100021)

间充质干细胞是一群能够形成克隆的成纤维样细胞。国际细胞和基因治疗学会(International Society for Cell & Gene Therapy,ISCT)对间充质干细胞的分类标准是:高表达CD73、CD90和CD105,不表达血液细胞标记如CD34、CD45、CD11b等[1]。间充质干细胞在组织再生修复、免疫调节等方面具有重要作用,在各组织器官中都有组织特异性的间充质干细胞[2]。肺作为多种动物的呼吸器官,机体通过肺与外界环境进行气体交换,各种有害物质如化学氧化剂、蛋白酶、病毒、细菌等都可造成肺损伤。尽管存在众多因素会导致肺损伤,但正常个体仍能保持正常的肺功能,这说明肺部具有强大的损伤修复和再生能力[3]。肺间充质干细胞(lung-resident mesenchymal stem cell,lr-MSC)首先是在肺灌洗液中发现的,2014年Rolandsson等[4]在支气管壁和肺实质的血管周组织中分离出lr-MSC,证实了lr-MSC的位置和表型等特征。与骨髓间充质干细胞相比,lr-MSC表达相似的表面蛋白,在转录组、蛋白质组和分泌组学等方面均有所不同[5-6],其在肺生理和病理过程中的作用,以及在治疗肺部疾病中的应用前景,还有待深入研究[2]。

本项目从C57BL/6J小鼠中利用两种方法分离培养了lr-MSC,对其的形态、生长特性、表面标记物及多向分化能力进行分析,发现lr-MSC为成纤维样细胞,表达Sca-1、CD90、CD29、CD44等干细胞表面标记,不表达血管内皮标记CD31和白细胞表面标记CD45,具有成脂、成骨分化能力。lr-MSC的分离、培养和鉴定可以为研究lr-MSC的功能提供体外模型。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级C57小鼠6只,体重18~22 g,4周龄,雌雄各半,购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2020-0004],实验操作在研究所解剖室进行[SYXK(京)2019-0014],实验方案经本研究所实验动物使用与管理委员会审批(BL17002),实验中按实验动物使用的3R原则执行。

1.2 主要试剂与仪器

细胞培养用胎牛血清(批号:1908360C)、α-MEM(批号:2120408)、DPBS(批号:2120391)、青链霉素(批号:2076677)、胰酶(批号:2062475)、流式抗体等均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;组织消化用Ⅰ型胶原酶(批号:9001-12-1)购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司;成骨(批号:191002G001、成脂(批号:191107G001)诱导培养液均购自赛业(苏州)生物科技有限公司;流式细胞仪为AriaⅡ,购自美国Becton Dickinson公司;CO2培养箱购自美国Thermo公司;倒置荧光显微镜购自德国Leica公司。

1.3 实验方法

1.3.1 肺间充质干细胞的分离培养

脱颈椎处死小鼠,75%乙醇浸泡消毒后,置于超净台上,无菌条件下分离肺组织,用PBS冲洗干净,剪成1 mm3小组织块,一半加入α-MEM完全培养基(含10%胎牛血清、1%青链霉素)直接接种6孔板,37℃,5% CO2培养,每3 d换液,细胞从组织块爬出融合达80%左右时,胰酶消化细胞进行传代,同时去除组织块;另一半加入等体积0.1%胶原酶Ⅰ,37℃振荡消化2 h,加入等体积PBS后离心,1500 r/min,5 min,弃上清,加入2 mL α-MEM完全培养基,经70 μm细胞筛过滤,计数,接种到6孔板,106细胞/孔,37℃,5% CO2培养。24 h后换液,此后每3 d换液,细胞融合达80%左右时,进行传代。

1.3.2 生长曲线测定

取第3代生长状态良好的细胞,接种24孔板,104个/孔。自接种后第2天起,每隔48 h取3孔消化计数,记录细胞数,绘制生长曲线。

1.3.3 流式细胞术检测干细胞比例

取第3代生长状态良好的细胞,胰酶消化收集细胞,计数,离心,1500 r/min,5 min,弃上清,加入适量PBS,调整细胞浓度为107/mL,取106细胞加入流式抗体,进行染色,4℃,30 min。染色抗体为:CD31-FITC,CD90-FITC,CD29-PE,CD45-PE,Sca-1-PE-cy7,CD44-APC-cy7。

1.3.4 诱导成脂

取第3代生长状态良好的细胞,接种24孔板,104个/孔,37℃,5% CO2培养,当细胞融合达80%以上时,吸弃培养基,加入2 mL成脂诱导培养基,之后每3 d换液,诱导21 d左右,观察细胞变化,对照组加α-MEM完全培养基。成脂鉴定采用油红O染色:吸弃诱导培养基,加PBS洗2次;加4%多聚甲醛固定30 min;吸弃多聚甲醛固定液,加入60%异丙醇洗2次;加入油红O染色液,染色60 min;吸弃染色液,加PBS洗3次,倒置显微镜观察、拍照。

1.3.5 诱导成骨

取第3代生长状态良好的细胞,接种24孔板,104个/孔,37℃,5% CO2培养,当细胞融合达60%~80%时,吸弃培养基,加入2 mL成骨诱导培养基,之后每3 d换液,诱导21 d左右。成骨鉴定采用茜素红染色:吸弃诱导培养基,加PBS洗2次;加4%多聚甲醛固定30 min;吸弃多聚甲醛固定液,加茜素红染色液,染色5 min;吸弃染色液,加PBS洗3次,倒置显微镜观察、拍照。

1.4 统计学方法

数据统计分析采用GraphPad Prism 6软件,结果用平均数±标准差(¯x±s)表示,组间比较用t检验,P<0.05,认为差异显著,有统计学意义。

2 结果

2.1 生长特性

本实验采用胶原酶消化和肺组织块直接培养两种方法分离lr-MSC。胶原酶消化法,在接种后第2天即可见细胞贴壁,之后迅速扩增;而组织块培养法,细胞贴壁较慢,第4天时可见细胞贴壁(图1)。两种方法分离的细胞传代至第三代时,细胞均为成纤维样形态,传代时间基本一致(图2)。

注:上行为肺组织经胶原酶Ⅰ消化后细胞贴壁生长状态,从左到右依次为培养2、5、8 d的细胞;下行为肺组织直接培养的细胞贴壁生长状态,从左到右依次为培养2、5、8 d的细胞。图1 原代肺间充质干细胞的贴壁生长状态Note.Upper line shows the status of cell adherent growth after collagenaseⅠdigestion,from left to right,the culture day is 2,5,8 days.Next line shows the status of cell adherent growth with lung tissues,from left to right,the culture day is 2,5,8 days.Figure 1 Lung mesenchymal stromal cells

注:A:细胞形态;B:生长曲线。图2 肺间充质干细胞的形态和生长曲线Note.A,Cell morphology.B,Growth curve.Figure 2 Morphology and growth curve of lung mesenchymal stromal cells

2.2 干细胞比例

取第三代细胞标记间充质干细胞表面标记物,阴性标记物CD45、CD31均为低表达,阳性标记物Sca-1、CD90、CD29、CD44的表达量均在90%以上(图3)。从细胞表面标记物表达来看,所得细胞符合干细胞特性。

图3 肺间充质干细胞的表面标记流式分析Figure 3 FACS results for the surface markers of lung mesenchymal stromal cells

2.3 诱导成脂能力

为检测lr-MSC的成脂分化能力,取第三代细胞接种至24孔板,成脂诱导液诱导21 d后,油红O染色,可见细胞内有红色脂滴,但仍有部分细胞未分化为脂肪细胞(图4)。

2.4 诱导成骨能力

为检测lr-MSC的成骨分化能力,取第三代细胞接种至24孔板,成骨诱导液诱导21 d后,茜素红染色,可见钙盐沉积着红色(图5)。

3 讨论

作为机体与外环境进行气体交换的器官,肺组织结构复杂,构成细胞较多,包括多种上皮细胞、内皮细胞和间充质细胞等[7]。Hegab等[8]分离了lr-MSC,发现这些细胞表型为Sca1+CD45-CD31-,体外培养时能够自我更新,并能分化成内皮细胞、肺泡上皮细胞等,同时还具有间充质干细胞的特性;将lr-MSC移植到肺损伤小鼠模型中,可以提高小鼠的生存率,减少肺损伤。已有研究表明,lr-MSC是肺组织修复和再生的重要调节因子,特发性肺纤维化是由lr-MSC分化为成肌细胞所导致的[9-10]。本研究采用胶原酶消化和肺组织块直接培养两种方法分离lr-MSC。胶原酶消化法,细胞贴壁快,可在较短时间内获得大量细胞;而组织块培养法,细胞贴壁较慢,第4天时可见细胞贴壁。在之后的传代过程中,两种方法分离所得细胞的增殖速度基本一致。本研究两种方法分离的细胞表型无差别,与Hegab等[8]分离的细胞表型一致,表现为Sca1+CD45-CD31-CD90+CD29+CD44+。在分化能力方面,本研究进行了成脂和成骨诱导分化,诱导21 d后分别形成了脂滴和钙盐沉积,可见所得lr-MSC具有多向分化能力。在诱导21 d后仍有部分细胞未分化,这可能与诱导液的诱导效率、诱导时间,以及lr-MSC细胞组成等有关,在后续研究中将调整诱导液各组分的浓度、延长诱导时间以提高诱导效率,同时分析lr-MSC多种表面标记,以深入了解lr-MSC的细胞组成情况。

注:A:对照组;B:诱导组。图4 肺间充质干细胞成脂分化Note.A,Control group.B,Induced group.Figure 4 Adipogenic differentiation of lung mesenchymal stromal cells

注:A:对照组;B:诱导组。图5 肺间充质干细胞成骨分化Note.A,Control group.B,Induced group.Figure 5 Osteogenic differentiation of lung mesenchymal stromal cells

本研究成功分离获得了lr-MSC,建立了稳定的lr-MSC分离、培养和鉴定技术体系,这将为后续深入研究提供基础。