肝素中脂质含量的测定方法研究

潘莎莎 陶翎 郭睿 恽卫东 朱栋 杨健 李幸 徐燕妮 邹海强 汪庆燕 周翔

（常州千红生化制药股份有限公司 江苏常州 213125）

1 前言

肝素钠是一种来自猪小肠黏膜中提取的硫酸氨基葡萄糖药物，属粘多糖类物质。作为源自天然成分的抗凝药主要用于防止血栓形成或深静脉血栓的治疗。临床使用中，由于存在发生肝素诱导的血小板减少症（heparin-induced thrombocytopenia，HIT）的风险[1]，会严重威胁患者生命安全，所以对肝素产品免疫原性的评估和管理非常重要。因肝素作为来源于猪等动物的生化药物，可能在肝素原材料如器官采集、切割、初产品加工等前道工序中混入不定量的脂类物质，而脂质作为杂质的一种，可能会作为免疫激动剂增强肝素的免疫原性[2]。因此本文建立一种针对肝素钠中脂质含量的检测方法，并进行方法学验证。

脂质不溶于水，易溶于有机溶剂。测定脂质大多采用低沸点的有机溶剂萃取的方法。常用的溶剂有乙醚，石油醚等。国内外药典（Ch.P.、USP等）中对于脂质的测定，均采用有机溶剂萃取，取有机层，将有机溶剂挥发干后，恒重称量，测得样品中脂质含量。因此，对于肝素中脂质的含量测定，以石油醚为提取剂采用索式提取法提取肝素中脂质后恒重称量的方法能符合肝素中脂质的检测要求。根据中国药典2015版二部附录XIX A《药品质量标准分析方法验证指导原则》、ICH Q2B《Validation of Analytical Procedures：Methodology》以及USP33-NF28<1225>《Validation of Compendial Procedures》对该方法进行范围、准确度、精密度和检测限的验证。

2 方法原理

脂质不溶于水，将经干燥后的供试品用石油醚回流提取，使供试品中的脂质进入溶剂中，蒸去溶剂后所得到的残留物，即为脂质。

3 仪器与试剂

天平（AB265-S，H020）；真空干燥箱（VD23，S136）；索式提取器；单标线吸管；刻度吸管。

肝素钠（注射级，常州千红生化制药股份有限公司18110211007）；石油醚（沸程30℃～60℃，国药集团化学试剂有限公司F20101014）；脂质（天津天源脂质有限公司15907）。

4 供试品分析的测定程序

（1）滤纸筒的制备：将8 cm×15 cm大小的滤纸，用直径约2 cm的试管为模型，将滤纸以试管壁为基础，折叠成底端封口的滤纸筒，筒内底部放一小片脱脂棉，置于干燥器中备用。

（2）样品处理：精密称取干燥并研细的样品5.000 g，无损的移入滤纸筒内。

（3）抽提：将滤纸筒放入索氏抽提器内，连接已干燥至恒重的脂质接收瓶，由冷凝管上端加入石油醚，加量为接收瓶的2/3体积，于水浴上加热使石油醚不断的回流提取3 h。

（4）称重：取下接收瓶，在水浴上蒸干，再于60℃真空干燥箱内干燥2 h，取出放干燥器内冷却30 min，称重，并重复操作至恒重。

（5）脂质结果计算公式为：

（ppm）＝（m2－m1）/m×106

式中：m2为接受瓶和脂质的质量，g；m1为接受瓶的质量，g；m为样品的质量，g。

5 可接受标准

（1）范围：回收率均介于90%～110%之间。

（2）准确度：回收率均介于90%～110%之间。

（3）精密度：①重复性：相对平均偏差<5%。②中间精密度：实验员2日内自身测定结果相相对平均偏差<5%，实验员之间测定结果相对标准偏差（RSD）<5%。

（4）检测限：当回收的脂质的量大于天平称量不确定度的3倍但小于其5倍时，该添加的脂质的量即为该检验方法的检测限；相对平均偏差<5%。

6 验证结果

6.1 空白试验

（1）精密称取肝素钠供试品2份，每份5.000 g，无损地移入干燥滤纸筒内，将滤纸筒放入索氏抽提器内，依法测定，计算出空白值（＝抽提后已恒重得接受瓶质量－抽提前恒重的接收瓶的质量），见表1。

表1 肝素钠供试品空白实验

（2）结论：5.000 g肝素钠样品的空白测得值为0.04 mg。

6.2 范围

（1）精密称取肝素钠供试品5份，每份5.000 g，无损地移入干燥滤纸筒内，将滤纸筒放入索氏抽提器内，分别加入含0.5 mg/ml的脂质的石油醚溶液（精密称取脂质500.0 mg，置于100 ml容量瓶中，用石油醚定容至100.0 ml，精密吸取上述溶液10.0 ml置100 ml容量瓶中，用石油醚定容至100.0 ml）1.5、1.3、1.0、0.7和0.5 ml，使得脂质的添加量分别为150、130、100、70和50 ppm。待有机溶剂挥发干后，依法测定，每份平行测定二次，计算出回收的脂质的量（扣除空白值），除以加入脂质的理论值，计算回收率。

（2）测定结果见表2。

表2 肝素钠供试品测定结果

（3）结论：定量加入1.5、1.3、1.0、0.7和0.5 ml含0.5mg/ml脂质的石油醚溶液，测得的平均回收率分别为94.6%、93.8%、94.0%、92.8%和96.0%，回收率均介于90%～110%之间，符合规定。

6.3 准确度

（1）精密称取肝素钠供试品3份，每份5.000 g，无损地移入干燥滤纸筒内，将滤纸筒放入索氏抽提器内，分别加入含0.5 mg/ml脂质的石油醚溶液1.2、1.0和0.8ml，使得脂质的添加量分别为120、100和80 ppm，待有机溶剂挥发干后，依法测定，每份平行测定二次，计算出回收的脂质的量（扣除空白值），除以加入脂质的理论值，求出回收率。

（2）测定结果见表3。

表3 肝素钠供试品的回收率

（3）结论：定量加入1.2、1.0和0.8ml含0.5mg/ml脂质的石油醚溶液，测得的平均回收率分别为94.2%、93.0%、93.8%，均介于90%～110%之间，符合规定。

6.4 精密度

6.4.1 重复性

（1）精密称取肝素钠供试品5.000 g，无损地移入干燥滤纸筒内，将滤纸筒放入索氏抽提器内，加入含0.5 mg/ml脂质的石油醚溶液1.0 ml，使得脂质的添加量分别为100 ppm，待有机溶剂挥发干后，依法测定，平行测定6次，计算出回收的脂质的量（扣除空白值），除以加入脂质的理论值，求出回收率，计算回收率的相对标准偏差（RSD）。

（2）测定结果见表4。

表4 肝素钠供试品回收率的相对标准偏差

（3）结论：脂质回收率的RSD为3.2%，<5%，符合规定。

6.4.2 中间精密度

（1）由2名实验人员，在2日内，对同一批肝素钠供试品按重复性试验进行添加回收试验，平行测定2份，计算回收率，然后计算该测定结果的相对平均偏差。

（2）测定结果见表5。

表5 肝素钠供试品的相对平均偏差

（3）结论：实验员A脂质回收率测定结果相对平均偏差为2.1%，实验员B脂质回收率测定结果相对平均偏差为1.1%，均<5%，符合规定；实验员A和实验员B脂质回收率测定结果RSD为2.0%，<5%，符合规定。

6.5 检测限

（1）精密称取肝素钠供试品5.000 g，无损地移入干燥滤纸筒内，将滤纸筒放入索氏抽提器内，分别加入含0.5 mg/ml脂质的石油醚溶液（配制记录见范围试验）1.0、0.7和0.5 ml，使得脂质的添加量为100、70和50 ppm，待有机溶剂挥发干后，依法测定，平行测定2份，计算出回收的脂质的量（扣除空白值）。将空的已恒重接收瓶置于天平上重复称量10次，求出该天平的称量不确定度（10次测定数据的标准偏差）。

（2）测定结果见表6、表7。

表6 肝素钠供试品的不确定度

表7 肝素钠供试品的检测限测定

其中，3倍不确定度为0.18 mg，5倍不确定度为0.30 mg。

按测得的检测限的量（0.25 mg）进行回收试验，依法测定，平行测定2次，计算相对平均偏差，见表8。

表8 肝素钠供试品的回收试验

（3）结论：上述脂质含量为50 ppm时，回收的脂质的量大于天平称量不确定度的3倍但小于其5倍，该添加的脂质的量即为该检验方法的检测限；相对平均偏差为4.2%，符合规定。

7 结论

综上所述，本方法具有较好的准确度和精密度，脂质含量检测限为50 ppm，脂质含量在50 ppm～150 ppm范围内回收率符合要求，可用于本公司肝素中脂质含量的检验。