分光光度法中比色皿的光程长度对实验结果的影响——以海水中亚硝酸盐氮的测定为例

孙欢，谭晓璇，屠建波，阚文静

(1.国家海洋局天津海洋环境监测中心站 天津 300457；2.自然资源部海洋咨询中心 北京 100161)

0 引言

分光光度法是最常用的定量分析方法之一，具有分析成本低、灵敏度高和操作快速便捷等特点，目前被广泛应用于水环境监测实验。常用的分光光度法主要包括紫外-可见光分光光度法、红外分光光度法、荧光分光光度法和原子吸收分光光度法。分光光度法测定水样中的物质含量通常根据比色液的颜色选用合适光程长度的比色皿:当比色液的颜色较浅时，应选用光程长度较大的比色皿(如5 cm)；当比色液的颜色较深时，应选用光程长度较小的比色皿(如1 cm 或2 cm)[1]。一些环境监测类的规范对分光光度法中比色皿的光程长度进行限定，如《海洋监测规范》规定荧光分光光度法测定石油类须选用1 cm的比色皿，异烟酸-吡唑啉酮分光光度法测定氰化物须选用3 cm的比色皿，萘乙二胺分光光度法测定海水中亚硝酸盐氮须选用5 cm的比色皿。

目前对分光光度法中比色皿的研究多集中于比色皿的选用对实验造成的误差以及误差消除等方面[2-8]，也有研究验证朗伯-比尔定律即探讨分光光度法中比色皿的光程长度与吸光值的关系，但这些研究均未分析比色皿的光程长度与水样中的物质含量测定结果之间的关系。本研究以萘乙二胺分光光度法测定海水中亚硝酸盐氮为例，探索选用不同光程长度的比色皿进行分光光度法实验测得水样中物质含量的差异性，以期为实际工作和改进实验方法提供参考。

1 实验

1.1 基本原理

在酸性介质中，亚硝酸盐与磺胺发生重氮化反应，其产物再与萘乙二胺偶合，显色生成红色染料；利用紫外分光光度计，于波长543 nm处测定比色液的吸光值，代入校准曲线可得水样中亚硝酸盐氮的含量。

1.2 仪器设备和试剂

实验采用T6新世纪紫外分光光度计和实验所需玻璃器皿，配制10 g/L磺胺溶液和1 g/L盐酸萘乙二胺溶液。选用2种亚硝酸盐氮标准系列，分别为自然资源部第二海洋研究所的亚硝酸盐氮标准系列(GBW 08640)和坛墨质检标准物质中心的水中亚硝酸盐氮标准溶液(BW 20002-1000-W-50)。

1.3 误差消除

在人员误差方面，实验人员操作仪器设备的熟练程度、测定比色液吸光值的个人习惯以及样品比色液与标准比色液处理流程的差异等原因都可能引起实验的主观误差。本实验的实验人员具有多年海水营养盐分析经验，同时严格按照《海洋监测规范第4部分:海水分析》(GB 17378.4—2007)中亚硝酸盐-萘乙二胺分光光度法的分析步骤进行实验。

在系统误差方面，同时选用1 cm、2 cm和5cm的3种光程长度的比色皿，为避免系统误差，选用校正合格的同一厂家和同一批次的石英比色皿，在测定比色液的吸光值时，分光光度计的比色皿架卡槽宽度应与比色皿的光程长度相适应。

1.4 实验方法

1.4.1 差异性验证实验

为验证选用不同光程长度的比色皿进行分光光度法实验所得水样中物质含量的差异性，采用萘乙二胺分光光度法，分别于8月4日和11月12日进行2个批次的独立实验，测定天津近岸海域海水样品中亚硝酸盐氮的含量，样品数量分别为20个和12个。采用亚硝酸盐氮标准系列(GBW 08640)作为实验校准曲线，曲线各点的含量分别为0 μg/L、7 μg/L、14 μg/L、28 μg/L和56 μg/L。待校准曲线与水样显色稳定后，分别选用1 cm、2 cm和5 cm光程长度的比色皿，依次测定校准曲线各点和水样的吸光值，计算得到水样中亚硝酸盐氮的含量，计算公式为:

隧道下穿处位于黄河冲洪积平原二级阶地，地下水位于地面以下16 m～17 m，为孔隙潜水，交叉处地层依次为粉土、粉砂、粉质黏土层。场地土层为不液化或可不考虑液化影响。计算分析按现地勘土体参数及水位。

p=(A-A′-a)/b×14

(1)

式中:p为水样中亚硝酸盐氮的含量；A为水样的吸光值；A′为分析空白的吸光值；a为校准曲线的截距；b为校准曲线的斜率。

计算结果如表1和表2所示。

表1 第一批水样中亚硝酸盐氮的含量 μg/L

表2 第二批水样中亚硝酸盐氮的含量 μg/L

1.4.2 准确度对比实验

以相对误差作为判定实验准确度的依据。实验步骤为:①用1 000 mg/L的亚硝酸盐氮标准溶液(BW 20002-1000-W-50)配制标准系列，其含量分别为0 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、120 μg/L、140 μg/L、160 μg/L和180 μg/L，按照萘乙二胺分光光度法实验步骤显色，分别选用1 cm、2 cm和5cm光程长度的比色皿依次测定标准系列各点的吸光值，每个点测量3次，得到亚硝酸盐氮标准系列的实测吸光值(表3)，并绘制各光程长度比色皿对应的校准曲线；②以已知亚硝酸盐氮含量为60 μg/L、80 μg/L、100 μg/L、120 μg/L和140 μg/L的水样作为内控样，经上述实验步骤测定吸光值后，代入相应校准曲线，得到内控样在不同光程长度比色皿测定下的含量实测值；③计算内控样实测值与真值的相对误差。

表3 亚硝酸盐氮标准系列的实测吸光值

1.4.3 校准曲线的不确定度分析实验

由式(1)可知，对实验结果产生影响的因子即不确定度来源于温度、水样和分析空白的吸光值以及校准曲线的拟合情况。由于实验已进行过误差消除，保证相同批次水样由相同实验人员在相同实验条件下测定，水样和分析空白吸光值的不确定度对于实验结果的影响可忽略不计，实验设计仅考虑对校准曲线的影响。实验步骤同准确度对比实验。

2 实验结果与讨论

2.1 实验结果的差异性

由表1和表2可以看出，不同光程长度的比色皿测得的水样中亚硝酸盐氮的含量不同，含量由高到低所对应的比色皿光程长度依次为1 cm、2 cm和5 cm。为进一步分析不同光程长度的比色皿测得亚硝酸盐氮含量的差异性，采用Z-score对实验结果进行标准化。Z-score是以标准差为尺度，可改变原始指标离散程度的信息(图1和图2)。

图1 第一批水样中亚硝酸盐氮含量的Z-score

图2 第二批水样中亚硝酸盐氮含量的Z-score

经标准化可以看出，不同光程长度比色皿的测定结果之间存在一定程度的离散，即测定结果存在差异。其中，1 cm与2 cm比色皿测定结果的差异性大于5 cm与2 cm比色皿测定结果的差异性。

(2)

计算结果如表4所示。

表4 实验结果的相对标准偏差

由表4可以看出，各组数据的相对标准偏差均不小于1%。可见当实验选用的比色皿光程长度不同时，测得水样中的物质含量也存在明显差异。

2.2 实验结果的准确度

经不同光程长度的比色皿测定，并将吸光值代入相应的校准曲线得到内控样的实测值，计算内控样实测值与真值的相对误差:

(3)

式中:δ为相对误差；Δ为实测值与真值之差；L为真值。

计算结果如图3所示。

图3 相对误差的实验结果

由图3可以看出，较小光程长度的比色皿测得结果的相对误差较小，即实验的准确度更高。

2.3 校准曲线的不确定度

以1 cm比色皿测定的亚硝酸盐氮标准系列吸光值为例，以各点吸光值的平均值与空白吸光值的差值为纵坐标、以亚硝酸盐氮含量为横坐标，绘制校准曲线:

y=0.003 2x+0.005 1，R=0.999 7

由此得到校准曲线的残余标准偏差:

式中:S为残余标准偏差；yi为xi点的实测吸光值；B为曲线斜率；A为曲线截距；n为测量校准系列的总次数，n=30。

同理，2 cm比色皿测定得到的校准曲线及其残余标准偏差为:

y=0.006 4x+0.009 2，R=0.999 5

S2 cm=0.011 64

5 cm比色皿测定得到的校准曲线及其残余标准偏差为:

y=0.015 0x+0.055 9，R=0.999 2

S5 cm=0.036 34

因此，在相同实验条件下，选用光程长度更小的比色皿测定比色液的吸光值，可使校准曲线的线性更好。

在校准曲线拟合的影响下，某水样经实验所得结果的不确定度为:

假设某水样经实验测定2次吸光值(P=2)，得到其亚硝酸盐氮的含量为70 μg/L。①若选用1 cm光程长度的比色皿测定，其不确定度为1.44 μg/L；②若选用2 cm光程长度的比色皿测定，其不确定度为1.33 μg/L；③若选用5 cm光程长度的比色皿测定，其不确定度为1.78 μg/L。

3 结语

本研究采用分光光度法，选用3种光程长度的比色皿测定同一比色液中的物质含量。①实验结果存在差异，即比色皿的光程长度越小，测得的物质含量越高，且1 cm与2 cm比色皿测定结果之间的差异性大于5 cm与2 cm比色皿测定结果之间的差异性；②由较小光程长度的比色皿测得结果的相对误差较小，实验的准确度更高；③在相同实验条件下测定校准曲线的吸光值，选用光程长度更小的比色皿的曲线线性更好；④以某水样中亚硝酸盐氮的含量为70.0 μg/L为例，若由光程长度分别为1 cm、2 cm和5 cm的比色皿测定，其不确定度分别为1.44 μg/L、1.33 μg/L和1.78 μg/L。

与此同时，本实验仍存在局限性，如实验次数和数据量较少、水样中物质含量的区间较小以及计算校准曲线的残余标准偏差时吸光值的测量次数较少，应在今后的研究中改进。