氮添加与凋落物管理对华北落叶松人工林土壤真菌群落的短期影响

王志波，季 蒙*，张海东，李永乐，李银祥

(1.内蒙古自治区林业科学研究院，呼和浩特 010010；2.兴和县苏木山林场，乌兰察布 013650)

凋落物是陆地生态系统重要组成部分，是连接土壤与植物的纽带[1]，为植物和微生物提供养分[2]，对促进生态系统养分循环和能量流动，维持土壤肥力等具有重要意义。土壤微生物是生物地球化学循环的重要参与者和调控者，在维持生态系统平衡、稳定和功能等方面起关键作用[3]。土壤真菌作为分解者，对外界变化十分敏感[4]，其组成、多样性、群落结构等可作为评价生态系统健康稳定的重要指标[5]。

氮沉降对土壤微生物的影响已引起全球的广泛关注，有研究认为，适量的氮添加可显著增加土壤微生物生物量[6]；多数研究结果表明，长期过量氮添加会给土壤微生物带来不利影响，降低微生物数量，改变群落结构[7-8]。添加与移除是凋落物主要管理措施，对土壤微生物的影响已开展了相关研究，主要采用磷脂脂肪酸法，结果发现，凋落物管理明显改变土壤微生物群落结构[2]。目前，有关氮添加与凋落物管理对土壤微生物的影响已经有相关报道，但大部分试验都是单一措施，对二者交互作用的研究相对较少。土壤微生物群落的影响因子并非单独出现，而是多因子共同作用，对多因子的交互作用效应进行研究尤为重要。

华北落叶松(Larixprincipis-rupprechtii)为松科落叶松属的落叶针叶乔木，内蒙古地区主要分布在阴山和燕山山地，是重要的山地造林树种。以阴山山地华北落叶松人工林为研究对象，以氮沉降增加为背景，对凋落物进行人为干扰，开展凋落物管理试验。利用高通量测序技术，分析短期氮环境变化和人为措施是否对土壤真菌群落组成、多样性和功能产生影响，并对氮添加和凋落物管理的交互作用进行探讨，以期为加速凋落物分解，促进养分循环，维持地力平衡等提供参考依据。

1 研究区域与研究方法

1.1 研究区概况

研究地点位于内蒙古兴和县苏木山林场，地处阴山山地东段，属中温带大陆性季风半干旱气候区，年均气温4.2 ℃，年均降水量397 mm，年均蒸发量2 060 mm，年均风速3.8 m/s，年均无霜期110 d。林场现有林地面积2.20万 hm2，主要乔木树种有华北落叶松、白桦(Betulaplatyphylla)、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)、油松(Pinustabuliformis)等。华北落叶松人工林面积0.68万 hm2，林下草本植物主要有苔草(Carextristachya)、唐松草(Thalictrumaquilegifolium)、地榆(Sanguisorbaofficinalis)、委陵菜(Potentillachinensis)、羊草(Leymuschinensis)、胡枝子(Lespedezafioribunda)等。通过本底调查，试验地地理坐标为东经113°47′25″、北纬40°33′42″，海拔2 100 m，坡度15°，林龄47年，平均密度567 株/hm2，平均树高19.37 m，平均胸径24.19 cm，林下凋落物平均厚4.5 cm。土壤为灰褐土。研究发现，随林龄增长，研究区华北落叶松人工林存在地力衰退趋势。

1.2 试验设计

采用两因素随机区组试验设计，包括3种氮添加处理(NT)和3种凋落物管理(LM)，交互后共9种措施。根据Liu等[9]研究结果，中国北方氮沉降量大约为25 kg/(hm2·a)，因此，试验按实际氮沉降量的2倍和4倍进行添加，分别为不施氮(NN:清水)、低氮[LN:50 kg/(hm2·a)]和高氮[HN:100 kg/(hm2·a)]。分3次施入，以 NH4NO3为氮源，溶解在10 L自来水中，使用喷壶喷施，为避免浓度交叉，设置10 m的隔离带。管理方式分别为保持原状(RM:不处理)、堆积(TG:将腐殖质层、半分解层和未分解层均匀混合后按2 m×2 m的距离堆积成直径50 cm、高40 cm的圆团状)和搅拌(MX:翻动、搅拌，将腐殖质层和凋落物层均匀混合后平铺)。施氮后立即对林下现有凋落物进行管理，初次喷氮后直接管理，第二次和第三次堆积管理时，根据施氮梯度将溶液等量均匀喷施在已堆积好的凋落物上，充分混匀后继续在原位置堆积。氮添加与凋落物管理时间为2018年7月、9月和2019年5月，周期为1年，为了更好地阐述土壤真菌群落特征对不同措施响应，第三次措施在次年的5月进行，7月土壤取样。每种措施3个重复，共布设10 m×10 m试验样方27块。

1.3 土壤取样及化学性质测定

土壤取样时间为2019年7月。取样时去除凋落物和腐殖质层，每个样方随机选取5个采样点，取样点距树干1.5 m以上。用土钻取0～10 cm层土壤，用无菌镊子挑除粗根、石块和其他杂物，将5个点的土样混合成一个样品，置于无菌自封袋中，混合均匀。每个样方的土样分成两部分，一部分迅速放入低温冷藏箱中，及时带回实验室，置于-80 ℃冰箱中保存，用于真菌高通量测序。另一部分在室温下风干用于土壤化学性质的测定，pH用pH 计测定，有机质采用重铬酸钾外加热法，全氮采用凯氏定氮法，全磷采用HClO4-H2SO4消煮-钼锑抗比色法，全钾、速效钾采用火焰光度法，碱解氮采用碱解扩散法，有效磷采用钼锑抗比色法，硝态氮采用酚二磺酸比色法，铵态氮采用靛酚蓝比色法。

1.4 土壤真菌多样性测试与分析

1.4.1 真菌DNA提取和ITS测序

采用十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trimethyl ammonium ammonium bromide，CTAB)法对基因组DNA进行提取[10]，每个样品3次重复，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度和浓度，无菌水稀释至1 ng/μL，以稀释后的基因组DNA为模板，使用ITS1区引物ITS5-1737F(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)和ITS2-2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)进行PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)扩增[11]。PCR 扩增体系为30 μL，包括Phusion Master Mix(2×)15 μL，Primer(2 μmol/L)3 μL(6 μmol/L)，gDNA(1 ng/μL)10 μL(5～10 ng)，H2O 2 μL。扩增条件为98 ℃预变性1 min，98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；再72 ℃ 5 min。根据PCR产物浓度进行等量混样，用2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，针对目标条带进行切胶回收。构建文库，经过Qubit检验定量，合格后使用NovaSeq6000上机测序。测序过程由北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成。

1.4.2 生物信息统计与分析

测序原始数据截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V1.2.7)软件[12]进行拼接，利用QIIME(V1.9.1)软件[13]进行质量控制，通过与物种注释数据库进行比对去除嵌合体序列，得到1 719 800条有效序列。利用UPARSE(v7.0.1001)软件[14]将有效序列以97%的一致性聚类成操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)，并选择出现频数最高的序列作为 OTU的代表序列。用QIIME软件与UNIT(v7.2)数据库[15]进行物种注释分析，统计各样品的群落组成。

采用 Excel 2007软件对数据进行整理和绘制柱状图，使用QIIME软件计算Chao1指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数，使用R(V2.15.3)软件绘制稀释曲线、花瓣图、Venn图，并进行典范对应分析(canonical correspondence analysis，CCA)。采用FunGuild数据库[16]对真菌群落的生态功能进行归类和预测。用SAS(V9.0)软件进行方差分析和多重比较(Duncan法)。

2 结果与讨论

2.1 土壤化学性质分析

由表1所示，氮添加显著提高土壤有效磷、速效钾、硝态氮含量，降低有机质含量，高氮土壤有效磷、硝态氮含量最大，分别为17.11 mg/kg和44.64 mg/kg，低氮土壤速效钾含量最大，为359.08 mg/kg。凋落物管理显著提高土壤有机质、全氮、有效磷、速效钾、硝态氮含量，均搅拌最大，分别为125.81 g/kg、3.97 g/kg、17.98 mg/kg、359.08 mg/kg、31.25 mg/kg。高氮堆积pH最小，为6.04；不施氮搅拌有机质含量最大，为125.81 g/kg；高氮搅拌有效磷、速效钾、硝态氮含量最大，分别为18.64 mg/kg、366.32 mg/kg、62.74 mg/kg。

表1 不同措施对土壤理化性质的影响

2.2 土壤真菌群落组成分析

在97%的相似度下进行OTU聚类，获得5 089个OTU，高氮搅拌最多，为2 405个。利用随机抽取的测序条数与其所代表的OTU数量构建稀释曲线，如图 1 所示，随着测得序列条数的增加，曲线趋于平坦，测序覆盖度均大于0.99，测序数据合理，能够真实反映土壤真菌群落组成。图2(a)花瓣图显示，9种措施共有OTU数目为428个，不施氮搅拌特有OTU数目最多，低氮保持原状最少。图2(b)韦恩图显示，单独氮添加共获得3 286个OTU，高氮最多，单独凋落物管理共获得3 197个OTU，搅拌最多。

图1 不同土壤样品稀释曲线

图2 不同措施土壤真菌OTU花瓣图与韦恩图

门分类水平，共鉴定出已知真菌门14个，优势门(相对丰度≥1%)是担子菌门(Basidiomycota)和子囊菌门(Ascomycota)，其次为被孢霉门(Mortierellomycota)和毛霉门(Mucoromycota)，如图3所示。这与前人研究基本一致，如:刘雷[17]对阴山主脉大青山华北落叶松根区、邓娇娇等[18]对辽东山区落叶松人工林土壤、李敏等[5]对阴山支脉乌拉山油松根围的土壤微生物群落研究，均认为土壤中真菌以担子菌门、子囊菌门为主，这主要因为针叶林凋落物量大，含有较高的木质素，为子囊菌和担子菌的生长提供了良好条件。氮添加显著增加土壤子囊菌门相对丰度，低氮最大，为43.81%，与He等[19]研究结果相同，短期适量的氮添加提高了土壤硝态氮、铵态氮等速效氮的含量，促进子囊菌门某些菌种的生长[20]。凋落物管理改变土壤碳输入环境，导致土壤养分状况发生变化，进而改变土壤真菌群落组成，管理后子囊菌门相对丰度显著增加，堆积最大，为71.67%。氮添加和凋落物管理限制担子菌门真菌对木质素的利用，进而抑制其生长[21]，相对丰度显著降低，分别在低氮和堆积最小，为22.77%和7.68%，引起土壤真菌群落结构朝子囊菌方向演替[22]。如表2所示，经两因素方差分析，交互作用显著提高土壤真菌子囊菌门相对丰度，降低担子菌门相对丰度，对被孢霉门和毛霉门相对丰度的影响不显著。如图3所示，担子菌门相对丰度不施氮保持原状最大，为79.37%；子囊菌门相对丰度不施氮堆积最大，为71.67%；被孢霉门和毛霉门相对丰度均高氮堆积最大，分别为12.39%和1.21%。

图3 不同措施土壤真菌门水平相对丰度

表2 不同措施土壤真菌优势门相对丰度方差分析结果

属分类水平，共鉴定出已知真菌属448个，相对丰度≥1%有24个，相对丰度≥10%的7个属中，乳牛肝菌属(Suillus)相对丰度不施氮保持原状最大，为67.59%；猪块菌属(Choiromyces)、糙缘腺革菌属(Amphinema)、威氏盘菌属(Wilcoxina)相对丰度低氮堆积最大，分别为31.27%、15.48%和20.83%；假裸囊菌属(Pseudogymnoascus)相对丰度不施氮搅拌最大，为13.84%；马鞍菌属(Helvella)相对丰度不施氮堆积最大，为13.57%；被孢霉菌属(Mortierella)高氮堆积最大，为11.28%；结果如图4所示。邓娇娇等[18]研究发现，辽东山区落叶松人工林优势真菌属为乳牛肝菌属、蜡壳菌属、棉革菌属等14个属，其中，乳牛肝菌属是对针叶树种具有较高侵染特异性的外生菌根真菌之一[23]，这与本试验研究结果相似，而有些菌属本研究未发现，说明同一植被类型不同区域土壤真菌群落组成和相对丰度存在一定差异。随氮添加量的增加，乳牛肝菌属相对丰度显著降低，高氮最小，为0.17%；高氮处理显著提高糙缘腺革菌属相对丰度，为10.15%；凋落物管理后，乳牛肝菌属相对丰度显著降低，搅拌最小，为0.12%；猪块菌属、马鞍菌属和被孢霉菌属相对丰度显著增加，均堆积最大，分别为11.03%、13.57%和6.36%。不同措施乳牛肝菌属的相对丰度均显著降低，从属水平上进一步说明氮添加与凋落物管理抑制担子菌门某些共生真菌的生长。研究发现，同一真菌门的不同属，对氮添加和凋落物管理的响应不同，在今后研究和应用中，针对某些特定的属和种需要进行深入分析。交互作用对威氏盘菌属、马鞍菌属、糙缘腺革菌属、乳牛肝菌属相对丰度的影响极显著，对猪块菌属、假裸囊菌属、被孢霉菌属相对丰度的影响不显著(表3)。

表3 不同措施土壤真菌优势属相对丰度方差分析结果

图4 不同措施土壤真菌属水平相对丰度

2.3 土壤真菌群落多样性分析

对9种措施的土壤真菌多样性(Alpha多样性)进行分析，单因素方差分析结果发现，不同措施Chao1指数、Ace指数差异不显著(P>0.05)，Shannon指数、Simpson指数差异极显著(P<0.01)。高氮搅拌措施的Chao1指数、Ace指数、Shannon指数、Simpson指数均最大，分别为1 600.27、1 636.56、6.75和0.97，如表4所示。氮添加显著提高土壤真菌Shannon指数和Simpson指数，Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均高氮最大，分别为1 385.99、1 420.00、6.41和0.96。凋落物管理同样显著提高Shannon指数和Simpson指数，Chao1指数、Ace指数、Shannon指数和Simpson指数均搅拌最大，分别为1 207.26、1 244.53、5.77和0.94。交互作用对Shannon指数、Simpson指数的影响极显著。

表4 不同措施土壤真菌Alpha多样性指数及方差分析结果

氮添加和凋落物管理通过改变土壤理化性质，间接改变土壤真菌生存环境，进而影响真菌群落多样性[24]。氮添加和凋落管理均显著增加土壤硝态氮含量，降低土壤pH，刺激嗜酸性真菌的大量生长，是导致Alpha多样性升高的主要原因[3]。真菌群落对土壤 pH 适应范围较宽，在微酸性条件下能够很好的生活，这与邓娇娇等[25]研究结果相同。也有学者研究结果与本试验相似，Liu等[26]认为pH是影响西南地区土壤真菌多样性最主要因素，呈现极显著的负相关性；田艳琴等[8]认为，施氮后土壤微生物多样性指数升高，施氮量为40 g/(m2·a)时最大。然而，有些结论则与本结果相反，Wang等[27]、李岩等[28]认为，氮增加显著降低土壤真菌Chao1 指数和Shannon指数，Shannon指数与pH呈正相关。由此可见，土壤真菌多样性对土壤理化性质的响应并不一致，这可能是受研究区域、树种组成以及其他土壤理化性质等因子的影响所致，有待进一步深入研究。

2.4 土壤真菌生态功能预测

不同措施土壤真菌群落可以划分为9个生态功能群，如图5所示，相对丰度较高(平均相对丰度≥1%)功能群有5种。其中，共生营养型(symbiotroph)相对丰度不施氮保持原状最大，为69.49%；腐生营养型(saprotroph)和病理营养型(pathotroph)相对丰度均高氮搅拌最大，分别为26.26%和9.11%；病理-腐生-共生过渡营养型(pathotroph-saprotroph-symbiotroph)相对丰度不施氮搅拌最大，为14.13%；病理-共生过渡营养型(pathotroph-symbiotroph)相对丰度不施氮堆积最高，为4.52%。由于FunGuild数据库是新近开发的工具[29]，其数据库还有待完善，利用其分析氮添加与凋落物管理对土壤真菌群落功能影响的研究鲜有报道，受现有参考资料的限制，各样品中仍有12.56%～72.74%的功能未被解析出来，还有待深入研究。本研究共生营养型平均相对丰度最高，通过与华北落叶松共生的方式来获取营养，并提高林木对养分的吸收能力，有利于林木生长，其次是腐生营养型，而在辽西北风沙区，土壤真菌主要以腐生营养型为主，腐生-共生营养型次之[25]，说明不同区域和植被类型，土壤真菌群落功能具有一定差异。氮添加和凋落物管理破坏了共生营养型真菌的生存环境，抑制其生长，相对丰度显著降低，这与Paungfoo-Lonhienne等[20]和聂三安等[29]研究结果相似。真菌生活史较为复杂，为了适应环境变化会同时采用多种营养方式[30]，因此，当土壤理化性质发生变化时，病理-腐生-共生过渡营养型、病理-共生过渡营养型等多种兼有型真菌相对丰度明显提高。如表5所示，交互作用对共生营养型和病理-腐生-共生过渡营养型真菌相对丰度的影响显著，对病理-共生过渡营养型真菌相对丰度的影响极显著。

图5 不同措施土壤真菌功能群相对丰度图

表5 不同措施土壤真菌功能群相对丰度方差分析结果

2.5 土壤真菌群落与化学性质的关系分析

基于属水平进行典范对应分析(canonical correspondence analysis，CCA)，研究土壤真菌群落与化学性质的关系，如图6所示，第一轴和第二轴累积解释变异量达到58.86%，表明土壤化学性质对真菌群落结构有很大的影响。其中，土壤 pH(R2=0.70，P=0.000 5)和硝态氮含量(R2=0.40，P=0.004 5)为主导真菌群落变化的主要因子，其次为全氮(R2=0.28，P=0.033 0)、碱解氮(R2=0.26，P=0.045 0)、有效磷(R2=0.27，P=0.045 5)和速效钾(R2=0.25，P=0.045 5)含量。其他相关研究也认为，pH是影响针叶人工林[18]、挪威北部群岛[31]、内蒙古西部地区土壤真菌群落结构的主要因子[32]；土壤硝态氮和有机质含量是影响宁南山区人工林[21]和乌拉山油松根围[16]土壤真菌群落结构的重要因素；有机质、速效磷含量是引起茶园土壤真菌群落结构产生变化的关键因素[22]。

OM为有机质；TN为全氮；TP为全磷；TK为全钾；AN为碱解氮；AP为有效磷；AP为速效钾；NO3.N为硝态氮；NH4.N为铵态氮

3 结论

在不改变凋落物现存量的基础上，首次对阴山山地华北落叶松人工林进行氮添加与凋落物管理试验，采用高通量测序技术，对表层(0～10 cm)土壤真菌群落进行分析，得到以下结论。

(1)不同措施土壤硝态氮、有效磷、速效钾等养分含量显著提高，pH降低。

(2)氮添加和凋落物管理后，子囊菌门相对丰度显著增加，担子菌门相对丰度显著下降。氮添加显著增加糙缘腺革菌属相对丰度，凋落物管理显著增加猪块菌属、马鞍菌属、被孢霉菌属相对丰度。两种处理方式均显著提高土壤真菌Shannon指数和Simpson指数。在9个真菌功能类群中，共生营养型平均相对丰度最高，其次是腐生营养型。

(3)土壤 pH和硝态氮含量是影响土壤真菌群落的主要因子。

(4)高氮搅拌措施的土壤有效磷、速效钾、硝态氮含量以及真菌OTU数目、Alpha多样性指数、腐生营养型真菌相对丰度等均最大，子囊菌门及其优势属的相对丰度也较大。因此，在营林过程中，可采用高氮搅拌措施对华北落叶松人工林林下凋落物进行管理，对促进凋落物分解，加快养分循环有重要作用。