藻蓝色素蛋白通过调控miR-642a-5p抑制LTEP-a2细胞的增殖和迁移

郝帅, 李爽, 刘媛璞, 王静, 赵磊, 王成涛

(1.北京工商大学 食品与健康学院，北京 100048;2.北京食品营养与人类健康高精尖创新中心,北京 100048;3.北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048)

肺癌是威胁人类健康最常见的恶性肿瘤之一,也是我国的第一大癌症,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占比约为85%,有较高的死亡率[1-2].目前肺癌治疗方法主要以外科手术或放化疗等传统的方法为主[3],但大多数肺癌患者发现时已经进入中晚期,这些传统的治疗手段并不能有效地提高肿瘤患者生存率[4].其次,肺癌早期临床诊断方法敏感度低、特异性差,治疗过程又缺乏有效的分子标志物进行动态监测指导治疗,因此,对于NSCLC的靶向治疗研究显得尤为重要[5].

miRNAs(microRNAs)是一类内源性的、约有19～23个核苷酸组成的单链非编码RNA,可以调控真核细胞诸多生理活动,包括细胞增殖、浸润、迁移、凋亡等.它们能够和靶基因的3’非翻译区配对结合,使得靶基因的表达水平在转录后受到抑制[6-8].研究表明,miRNAs与包括NSCLC在内的多种癌症的调控过程相关[9].

miRNA在不同肿瘤的发展过程中担任不同作用[10]:既能担当抑癌因子,又作为致癌因子调控肿瘤生长、迁移进程[11-12],因此,miRNA的特异性表达在肿瘤的发生和发展中起到关键作用.MONTERDE-CRUZ等[13]对骨肉瘤患者与健康供者血清进行了miRNA差异分析,结果发现与健康对照组相比,miR-642a-5p在骨肉瘤中出现过表达,提示miR-642a-5p可以作为骨肉瘤的潜在标志物.LIN等[14]通过分析癌症基因组图谱和结肠癌患者的测序数据,发现了miR-642a-5p的ceRNA调控机制,确定了LINC01234-miR642a-5p-SHMT2在结肠癌增殖中起关键作用,为结肠癌的诊断和治疗提供了一个潜在的新靶点.在前期研究中,发现天然功能性食用色素藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)能够显著抑制非小细胞肺癌的增殖和迁移[15-16],但深入的调控机制尚不清楚.藻蓝色素是一种源于螺旋藻、蓝藻细胞中的捕光蛋白,在螺旋藻中含量较高[17],由脱辅基蛋白亚基(α,β)和藻蓝素辅基结合形成的水溶性蛋白复合体,是藻胆蛋白的重要组成部分.藻蓝色素除了作为优良的食品着色剂,还兼具抗氧化、抗病毒、抗炎症等多种生理功能,是一种重要的药食同源型食品添加剂[18-19].文中以非小细胞费肺癌LTEP-a2细胞为模型,寻找藻蓝蛋白抑制细胞活性的关键miRNA,从小分子层面探究其调控规律为NSCLC的治疗提供了理论依据.

1 实验材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

人类非小细胞肺癌LTEP-a2细胞由本实验室自主保存;miR-642a-5p mimics/Neg.mimics、Hairpin-it miRNAs定量试剂盒购自上海吉玛制药有限公司;NF-κB抗体试剂盒购自美国Cell Signaling Technology公司;MMP2和MMP9购自美国abcam抗体公司;藻蓝色素蛋白标品购自宾美生物公司;藻蓝色素标品购自宾美生物;胎牛血清购自天津康源生物技术有限公司;1%青霉素-链霉素双抗、1×PBS缓冲溶液购自美国Corning公司;胰酶细胞消化液、姬姆萨染液、四甲基偶氮唑蓝MTT购自碧云天生物技术有限公司;RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制剂、磷酸化蛋白酶抑制剂购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司;PVDF膜购自Millipore公司;Protein Maker购自天根生物技术有限公司;BD脱脂奶粉购自美国BD公司;ECL化学发光液购自Millipore公司.

DNA浓度测定仪购自美国Thermo公司;Tanon5200全自动化学发光图像分析仪购自北京原平皓生物技术有限公司;聚丙烯酰胺凝胶电泳仪及膜转印装置购自美国Bio-Rad公司.

1.2 细胞培养

LTEP-a2细胞株培养于添加10%胎牛血清的DMEM培养基中,培养条件为37℃、5%二氧化碳恒温细胞培养箱中传代培养.

1.3 miRNA转录组测定

将藻蓝色素蛋白处理的细胞(处理浓度为4.8 μmol/L)和对照组细胞进行转录组测序,首先提前12 h将用于转录组测序的细胞传代并铺于细胞培养皿中培养,对照组为A-1,A-2,A-3,藻蓝蛋白处理组为实验组编号为B-1,B-2,B-3,将实验组细胞培养基替换为含有藻蓝蛋白的培养基继续培养48 h收集细胞,提取细胞总RNA;利用生物学手段对总RNA处理并构建cDNA文库,通过RNA-seq测序以及生物信息学分析等手段构建出藻蓝蛋白处理组、实验组差异miRNA转录组文库.

1.4 miR-642a-5p mimics的瞬时转染

采用瞬时转染法将化学合成的miR-642a-5p mimics、Neg.mimics转染到细胞中,并进行下游细胞实验.将合成的mimics用DEPC水溶解为20 μmol/L的储存液,适量分装并于-80℃保存备用;转染终浓度为50 nmol/L,具体转染步骤根据脂质体转染试剂Lipofectamine3000说明书操作.

1.5 细胞生长曲线、集落的测定

将转染12 h的细胞胰酶消化、离心收集计数,铺于96孔板中,6 h细胞贴壁后加入MTT,6 h再加入SDS-HCl裂解液,12 h后测定细胞570 nm处吸光值.连续测定0～5 d吸光值并记录数据.以横坐标为时间,纵坐标为吸光值(OD值),绘制细胞的生长曲线,统计细胞0～5 d生长情况.同时将转染12 h的细胞以200个/孔的量铺于6孔板中,加入2 mL培养基,放入培养箱中培养10 d,当集落大小肉眼可见时,利用吉姆萨染液对细胞集落染色,拍照保存并计算细胞克隆数.

1.6 细胞划痕实验

将转染mimics的阴性对照组和实验组细胞培养至细胞汇合度为90%单层铺满,利用灭菌的黄枪头快速划过培养皿内的细胞划出划痕标记,用培养基冲去细胞碎片,随后用3%血清的培养基培养,分别在0,24,48 h时定点拍照并保存,同时计算细胞迁移率.根据划痕宽度H计算迁移率A公式如下

A=[(H1-H2)/H2]×100%

式中:H1为实验组;H2为对照组.

1.7 荧光定量PCR

使用TRIZOL试剂提取细胞总RNA,采用NANO Drop2000测定RNA浓度,用DEPC水调平每组浓度,分别取3 μg总RNA应用miRNA逆转录试剂盒逆转录得到cDNA;取2 μL cDNA和适量SYBR酶和miR-642a-5p、U6(内参)引物进行荧光定量PCR定量分析miR-642a-5p的表达.引物序列如表1所示.

表1 定量PCR引物序列

1.8 Western Blotting

收集转染48 h后的细胞,RIPA裂解液抽提细胞总蛋白.将Marker、对照组、实验组进行SDS-PAGE蛋白分离,随后将分离的蛋白转移到PVDF膜上,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,使用其特异性抗体与目的蛋白孵育过夜(4 ℃),第2天37 ℃ 1 h孵育二抗,充分洗净后,滴加化学发光液,利用Tanon5200全自动化学发光图像分析仪对条带曝光,获得蛋白表达信号后拍照保存.

1.9 统计分析

柱状图和折线图中的实验数据均以平均数±标准差(mean±standard deviation)表示,采用SPSS 11.0软件进行单因素方差分析,其中p<0.05为显著性差异(*);p<0.01为极显著差异(**).

2 结果与讨论

2.1 藻蓝色素蛋白抑制LTEP-a2细胞体外增殖、迁移能力

在前期研究中,以非小细胞肺癌LTEP-a2为模型,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测以及划痕愈合、荧光定量PCR、Western等实验探究了藻蓝蛋白对LTEP-a2细胞的影响.从结果中发现藻蓝蛋白能明显抑制LTEP-a2细胞的体外增殖能力;同时,划痕实验、经典迁移基因表达检测结果证明了藻蓝蛋白可以显著抑制细胞的体外迁移能力[20].但这一过程中的小分子调控机制还尚不清晰(图1).为了深入探索藻蓝蛋白的抗肺癌机制,本文进行了深入的探究.

图1 藻蓝色素蛋白抑制LTEP-a2细胞体外增殖、迁移能力Fig.1 The inhibition ability of phycocyanin to the proliferation and migration of LTEP-a2 cells in vitro

2.2 miRNA转录组学筛选差异miRNA并体外验证

首先提取了藻蓝色素处理后的A549细胞总RNA,并进行miRNA转录组测序前的质量检测.图2分别为对照组(图2(a)和藻蓝色素处理组(图2(b))的RNA完整性分析结果.图2结果显示,RNA条带清晰,无色素、蛋白、糖类等杂质污染,RNA的18 S和28 S亚基处的峰完整且集中程度较高,28/23 S亮度大于18/16 S.初步显示了RNA结构的完整性.此外,表2显示了RNA质量检测的相关数据,表2结果显示,1～6组样品中,每组RNA总量均大于5 μg,浓度大于250 ng/μL,OD260/280均大于1.8,RNA的RIN值均大于8,总量满足2次建库需要.以上结果表明RNA样本结构完整,没有发生明显降解,符合样本要求,可以进行后续的miRNA转录组测序分析.

图2 藻蓝蛋白处理组与对照处理组LTEP-a2细胞中的RNA完整性检测Fig.2 RNA integrity test in phycocyanin-treated and control LTEP-a2 cells

表2 不同样本RNA的质量检测数据

通过高通量测序筛选和统计学分析,筛选出了一系列藻蓝蛋白处理后差异表达的miRNA.图3为差异miRNA筛选火山图(volcano-plots),图中每个点代表一个特定的miRNA,▲表示显著上调的miRNA,▼表示显著下调的miRNA,●为非显著差异miRNA,并且,越靠两侧和上端的点表达差异越显著.本文筛选到了一个感兴趣的上调表达的miRNA,miR-642a-5p(log2FC(PC/control为1.02),并且进行了转录组的qRT-PCR验证.图3 qRT-PCR结果显示,藻蓝蛋白处理后,miR-642a-5p相对表达量约为对照组的5倍,这与转录组的趋势是一样的.以上结果说明藻蓝蛋白作用LTEP-a2细胞后确实能上调miR-642a-5p的表达.

图3 藻蓝蛋白处理LTEP-a2细胞后的miRNA转录组分析Fig.3 miRNA transcriptome analysis of LTEP-a2 cells after treatment with phycocyanin

2.3 qRT-PCR检测转染mimics后LTEP-a2细胞miR-642a-5p的过表达效果

miR-642a-5p在多种肿瘤细胞中参与了调控作用[13-14],那么它是否也介导了藻蓝蛋白抑制非小细胞肺癌生长的调控过程呢？为了验证猜测,首先在LTEP-a2细胞中分别转染了miRNA模拟物Neg.mimics和miR-642a-5p mimics,48 h后采用miRNA qRT-PCR检测了miR-642a-5p在细胞内的表达.

结果显示,与对照组相比,在外源转染mimics后,LTEP-a2细胞内miR-642a-5p的表达量显著升高(如图4所示).综上所述,在LTEP-a2细胞中miRNA mimics的转染效率很高,可以进行后续的实验.

图4 转染后实时荧光定量PCR检测miR-642a-5p在LTEP-a2细胞内的表达Fig.4 Expression of miR-642a-5p in LTEP-a2 cells after transfection detected in real time by fluorescence quantitative PCR

2.4 过表达miR-642a-5p对LTEP-a2细胞体外增殖能力的影响

转染miR-642a-5p后,采用MTT的方法检测了细胞的体外增殖能力.结果显示,与对照组相比,过表达miR-642a-5p后明显抑制了细胞的体外增殖能力,处理后的第4天起细胞增殖出现极显著差异(如图5所示).此外,培养2 w后,转染miR-642a-5p组细胞的集落个数明显少于对照组(图5),同时结果具有统计学意义.以上结果表明,miR-642a-5p确实能够显著降低LTEP-a2细胞的体外增值能力.

图5 过表达miR-642a-5p对LTEP-a2细胞体外增殖能力的影响Fig.5 Effect of miR-642a-5p overexpression on the in vitro proliferation of LTEP-a2 cells

2.5 过表达miR-642a-5p抑制LTEP-a2细胞的体外迁移能力

在LTEP-a2细胞转染miR-642a-5p mimics 24,48 h后对迁移距离进行了测量和统计.如图6(a)6(b),结果显示,LTEP-a2细胞转染阴性对照24,48 h后的平均迁移率为14.5%,19.6%,而转染mimics 24,48 h后的平均迁移率为6.5%,15%,细胞的迁移能力有所下降,说明LTEP-a2细胞在过表达miR-642a-5p后体外迁移能力受到抑制.随后检测了过表达miR-642a-5p后细胞内迁移相关蛋白MMP2,MMP9的表达水平.基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)作为一类调节细胞迁移功能的重要的蛋白酶,对调节细胞外基质生长有重要作用,同时,血管是细胞外基质的主要成分,血管形成是肿瘤转移的主要因素,MMP2,MMP9均属明胶酶类,是能够降解IV型胶原的主要基质水解酶,其中MMP9是MMPs系统中最大的酶,MMP2能降解I型胶原纤维,均与细胞迁移密切相关,并在恶性肿瘤中都有过度的表达[21-22].图6(c)6(d)显示mimics转染48 h后的实时荧光定量PCR,结果显示,细胞中MMP2、MMP9转录物的量有所下调,同时Western Blot结果也显示,在LTEP-a2细胞过表达miR-642a-5p后,MMP2,MMP9蛋白水平的表达同样也是下调的.以上结果表明过表达miR-642a-5p能够抑制LTEP-a2细胞的体外迁移能力.

图6 过表达miR-642a-5p抑制LTEP-a2细胞的体外迁移能力Fig.6 Inhibition ability of mir-642a-5p overexpress to the migration of LTEP-a2 cells in vitro

2.6 过表达miR-642a-5p对LTEP-a2细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

NF-κB是一个有5个重要转录因子的家族,在响应基因的启动子区域,可以形成或与之结合形成共识的DNA序列,进而调节细胞增殖、凋亡和分化[23].为了探究藻蓝蛋白是否能够通过介导miR-642a-5p影响NF-κB通路的活性而影响细胞的增殖、迁移等生理功能,对通路蛋白的水平进行了检测.图7显示,藻蓝蛋白处理LTEP-a2细胞后,IKKα/β,IκBα,p65蛋白的磷酸化水平显著降低.IKKα,IKKβ是IκBα的催化亚基,同时也作为p65蛋白的抑制剂,IKKα/β蛋白磷酸化可以使IκBαSer 32位发生磷酸化,导致IκBα的蛋白酶体依赖性降解,接着是p65磷酸化和NF-κB激活[24].而miR-642a-5p过表达后,同样可以发现蛋白的表达与藻蓝蛋白处理后基本一致,因此,研究结果表明miR-642a-5p参与了藻蓝蛋白抑制NF-κB通路的过程,从而影响了LTEP-a2细胞的增殖和迁移.

图7 过表达miR-642a-5p对LTEP-a2细胞NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响Fig.7 Effect of miR-642a-5p overexpression on the expression of NF-κB signaling pathway proteins in LTEP-a2 cells

2.7 抑制miR-642a-5p的表达促进LTEP-a2细胞的增殖和迁移能力

为了进一步证实miR-642a-5p对细胞增殖和迁移的影响,进行了miR-642a-5p的敲低实验.采用miR-642a-5p抑制剂转染LTEP-a2细胞,并对细胞的增殖和迁移能力进行了检测,图8结果显示,抑制miR-642a-5p的表达后,能够显著促进LTEP-a2细胞的体外增殖和迁移能力,这一结果与过表达miR-642a-5p正好相反,进一步对本研究的结果进行了证实.

图8 抑制miR-642a-5p对LTEP-a2细胞生长和迁移的影响Fig.8 Effect of miR-642a-5p inhibition on the proliferation and migration of LTEP-a2 cells

3 结 论

本研究以LTEP-a2典型的非小细胞肺癌细胞为研究模型,通过藻蓝蛋白处理后,采用高通量miRNA转录组测序,对差异miRNA进行筛选,获得一个感兴趣的上调miRNA miR-642a-5p,体外验证miRNA的表达量与转录组一致.随后对转染miR-642a-5p的细胞的增殖和迁移能力进行检测,发现miR-642a-5p在细胞中的过表达能使细胞生长缓慢,克隆形成能力削弱;同时,划痕愈合能力也大大减弱,经典迁移蛋白 MMP2、MMP9在转录水平和蛋白水平上都有明显降低.研究结果能够为功能性藻蓝色素蛋白的应用和非小细胞肺癌的治疗提供理论基础.