pH敏感型黄原胶/聚乙烯醇水凝胶的制备与表征*

刘 静，徐梦洁，张秀梅，徐 涛，郭 媛，陈维毅，黄 棣

(1. 太原理工大学 生物医学工程学院生物医学工程系，纳米生物材料与再生医学研究中心，太原 030024；2. 太原理工大学 生物医学工程研究所, 材料强度与结构冲击山西省重点实验室, 太原 030024)

0 引言

水凝胶是一种能在水中溶胀但不溶于水的高分子材料，由于其含水率和结构等与生物组织相似，具有良好的生物相容性，因此被广泛地应用于药物缓释载体、组织工程支架、皮肤敷料等生物医学领域[1]。目前研究和应用最广泛的是pH敏感型水凝胶和温敏型水凝胶，pH敏感型水凝胶是指水凝胶的体积随外界pH值或离子强度的变化而发生改变的一类水凝胶[2-3]。本课题研究一种pH敏感型水凝胶的溶胀-消溶胀行为从而表现出水凝胶的pH敏感性来控制药物的缓释。

目前用于制备水凝胶的高分子材料有天然和人工合成两类[4-5]，但都存在不足之处，为了满足符合人体内部条件及具有良好生物相容性的材料，对两种高分子材料进行复合来综合其优良性能[6]，本研究制备黄原胶/聚乙烯醇(Xanthan Gun/Polyvinyl alcohol，XG/PVA)水凝胶。PVA是一种无毒副作用、可降解且具有机械性能的人工合成材料，制备出的水凝胶虽然具有可调节的性能及降解性[7-9]，但与天然高分子相比其生物相容性较差，XG是一种无毒、可降解、生物相容性好的天然高分子材料[10-13]，本实验采用化学交联结合物理交联的方式制备出一种XG/PVA复合水凝胶，研究XG与PVA不同质量比、不同交联剂用量及不同冷冻-解冻循环次数对XG/PVA水凝胶溶胀性能和力学性能的影响，确定最优实验条件制备水凝胶，进一步研究其pH敏感性及溶胀-消溶胀动力行为，同时以牛血清蛋白(Bovine serum alumin，BSA)为模拟药物，研究其在该水凝胶中的释放行为，及其生物相容性的研究，结果表明XG/PVA复合水凝胶有望在药物控释方面有所应用。

1 实验

1.1 主要原材料

XG：上海麦克林生化有限科技有限公司；PVA(10500)：西陇科学股份有限公司；环氧氯丙烷：分析纯，上海麦克林生化有限科技有限公司；氢氧化钠：天津市北辰方正试剂厂。去离子水由四川优普纯水仪制备(18.2 MΩ·cm)。

1.2 主要仪器与设备

集热式恒温磁力搅拌浴，HWCL-3，郑州长城科工贸有限公司；强力电动搅拌机，JB50-D，上海标本模型厂制造；冷冻干燥机，FD-1A-80，上海比朗仪器制造有限公司；扫描电子显微镜(Scanning electric microscopy，SEM)，JSM-7100F，日本Jeol公司；电子万能试验机，Instron5544，美国INSTRON；傅里叶红外光谱仪(Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR)，Nicolet iS10，美国Thermo Scientific公司；细胞培养箱，Forma311，美国Thermo Scientific公司；荧光倒置相差显微镜，TiS，日本Nikon公司。紫外分光光度计，SP-756，上海光谱仪器有限公司。

1.3 试样制备

将一定量的XG和PVA混合在90 ℃机械搅拌下溶于200 mL去离子水中，待溶解完全后冷却至室温，再加入2 g氢氧化钠和一定量的交联剂环氧氯丙烷，搅拌均匀后倒入模具，放入冰箱进行冷冻-解冻循环即制得XG/PVA复合水凝胶。

1.3.1 XG与PVA的不同质量比

分别称取2 g的XG和6、10、14 g的PVA混合加入200 mL的去离子水中，使XG与PVA质量比分别为1∶3、1∶5、1∶7，按照上述实验步骤，再加入10 mL的环氧氯丙烷搅拌均匀后倒入模具放入冰箱进行2次冷冻-解冻循环即制得一系列XG/PVA复合水凝胶。

1.3.2 交联剂的不同用量

取XG与PVA的质量比为1 : 5，按照上述实验步骤，分别加入6、10、14 mL的环氧氯丙烷到混合溶液中，使交联剂用量为3%、5%、7%，搅拌均匀后倒入模具放入冰箱进行2次冷冻-解冻循环即制得一系列XG/PVA复合水凝胶。

1.3.3 冷冻-解冻循环的不同次数

取XG与PVA的质量比为1∶5，交联剂用量为5%，按照上述实验步骤，得到混合溶液后倒入模具放入冰箱进行冷冻-解冻循环，在-20 ℃下冷冻21 h常温下解冻3 h为1次，分别进行1次、2次、3次的冷冻-解冻循环即制得一系列XG/PVA复合水凝胶。

1.4 性能测试

1.4.1 水凝胶溶胀性能的测定

采用重量法对水凝胶进行溶胀性能测试，将制得的试样在冷冻干燥机中进行冷冻干燥，将干燥的样品称重后室温下浸泡在pH = 5的PBS中24 h，取出用滤纸拭去表面水分后称重，每组样品做3次平行试验。水凝胶的溶胀率(SR)按公式计算[7]：

其中Ms是达到溶胀平衡时凝胶重量；Md是烘干后干凝胶重量。

1.4.2 水凝胶力学性能的测定

将水凝胶切割成厚度10 mm的圆柱体，用Instron5544万能材料试验机对其进行压缩力学性能测试，设置压缩速度为3 mm/min，得到应力-应变曲线，每组样品做3次平行试验，采用开始压缩至产生10%应变的线性阶段进行线性拟合得到压缩模量。采用应变至60%时，单位面积下的应力作为压缩强度。

1.4.3 SEM观察

将经过冷冻干燥机干燥后的材料切割成厚度为1 mm的片状，固定在样品台上，表面喷铂金(Pt)，观察XG/PVA复合水凝胶的内部结构。

1.4.4 FT-IR分析

利用KBr压片法，用FT-IR技术对冷冻干燥后的XG、PVA、XG/PVA水凝胶进行FT-IR分析，通过图谱中的特征峰来观察材料的交联机理。

1.4.5 pH敏感性的测定

将冷冻干燥后的样品称重后，室温下分别浸泡在不同pH值的PBS中，每隔一段时间后取出拭去表面水分称重，计算水凝胶的溶胀率。每组样品做3次平行试验。

1.4.6 pH响应性的测定

将冷冻干燥后的样品称重后，室温下预先在pH=7.0的PBS中溶胀24 h，然后分别置于pH=5.0和pH=10.0的PBS中，每隔2 h交替置于pH=7.0的PBS中，取出拭去表面水分计算溶胀率。每组样品做3次平行试验。

1.4.7 包埋BSA水凝胶的体外释放测定

在XG/PVA共混溶液时加入BSA，制备BSA含量为0.5%(质量分数)的复合水凝胶，把载BSA水凝胶分别置于5 mL pH分别为2.5、7.0和10.0的PBS中，每隔一段时间后取出5 mL溶液并补充5 mL新鲜PBS，于279 nm处用紫外-可见分光光度计测定BSA的释放量，每组样品做3次平行试验，绘制BSA的累计释放曲线。

1.4.8 细胞相容性

本实验采用CCK8法进行细胞增殖和毒性分析。将XG/PVA水凝胶冷冻干燥后制成约Φ10 mm × 1 mm的薄片，利用高压蒸汽灭菌法灭菌处理后放入24孔培养板，同时设空白组。将MG63细胞悬液以1×104个/mL的浓度接种于24孔板中，每孔1 mL。移至细胞培养箱中(37 ℃，5% CO2)，每组3个平行样，隔天换培养液，分别于1、4和7天利用倒置相差显微镜观察细胞在材料周围生长情况，并拍摄照片。同时向每孔中加入10 μL的CCK8溶液，再放入培养箱3 h，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值(OD)。

2 结果与讨论

2.1 XG/PVA复合水凝胶溶胀动力学

图1为影响XG/PVA水凝胶溶胀性能的实验条件因素，如图所示，随着PVA量或交联剂量的增加，溶胀率出现先上升后下降的趋势；随着冷冻-解冻循环次数的增加溶胀率下降后基于平缓。这可能是因为，通过物理与化学的交联作用，交联程度大的凝胶内部结合紧密，溶胀率小。在XG与PVA质量比为1∶3时，或交联剂用量为3%时，XG/PVA复合凝胶的溶胀率较小，说明此时凝胶内部通过化学交联作用变得紧密[13-14]，之后随着PVA量或者交联剂量的增加，凝胶内部形成了更加均匀、更多的孔隙结构，空隙的总体积增加，从而表现出良好的溶胀行为，而下降可能是因为过量的PVA或交联剂会发生一定的团聚现象，凝胶单位体积的孔隙率相对减少所致。随着冷冻-解冻循环次数的增加，凝胶物理交联点增多，高分子交联点间距变小，溶胀率减小，在物理交联达到饱和后，凝胶形成均匀孔隙结构，溶胀率基于平稳。故凝胶在XG与PVA质量比为1∶5时，交联剂用量为5%，进行3次冷冻-解冻循环时具有最佳的溶胀性能，此时溶胀率达到241%。

图1 不同实验条件下的XG/PVA水凝胶的溶胀率

2.2 XG/PVA复合水凝胶力学性能

图2为影响XG/PVA水凝胶压缩弹性模量和压缩强度的实验条件因素，如图2所示，随着PVA量或交联剂量的增加，力学性能出现先上升后下降的趋势；随着冷冻-解冻循环次数的增加力学性能不断增强。这是因为随着PVA量的增加凝胶内部形成了更加均匀的孔隙结构，且PVA本身具有一定的机械性能，从而力学性能增强，而下降可能是因为过量的PVA改变了凝胶已有的网络结构，使其力学性能降低。交联剂的用量影响着凝胶的交联程度，随着交联剂用量的增加，凝胶化学交联程度变大，内部结构紧密，孔隙均匀存在，从而力学强度增加，之后过量的交联剂在凝胶交联程度达到饱和后作为异物存在于凝胶中，阻碍了凝胶的网络通道影响力学性能。冷冻-解冻循环通过凝胶内部高分子链间氢键，离子键等物理作用交联凝胶，随着冷冻解冻循环次数的增加，水凝胶内的物理交联点增多，高分子交联点之间的距离减小，凝胶内部结合紧密，力学性能增强[7]。与溶胀率相一致，凝胶在XG与PVA质量比为1∶5时，交联剂用量为5%，进行3次冷冻-解冻循环时具有良好的力学性能，此时水凝胶的压缩弹性模量和压缩强度达到(26.30±0.03)kPa和(134.36±0.43)kPa。

图2 不同实验条件下的XG/PVA水凝胶的力学性能

这就说明可以通过改变原料的不同质量比、交联剂不同用量和冷冻-解冻循环不同次数来控制XG/PVA复合水凝胶的溶胀性能及力学性能，这也对于控制药物在体内的缓释发挥出一定作用。当XG与PVA质量比为1∶5，交联剂环氧氯丙烷用量为5%，冷冻-解冻循环3次时，XG/PVA复合水凝胶内部结构均匀紧密且具有较高的溶胀性能和良好的力学性能。之后对该实验条件下制备的XG/PVA复合水凝胶进一步表征。

2.3 XG/PVA水凝胶SEM观察

从SEM可以看出，XG/PVA复合水凝胶内部存在着明显的孔隙结构，形成了互穿网络结构，说明该凝胶成功交联合成，且存在着明显的孔通道，是具有良好的溶胀性能和力学性能的原因。XG/PVA水凝胶通过化学与物理交联作用成功形成了网状结构。

2.4 XG/PVA水凝胶红外分析

图4为XG、PVA、XG/PVA复合水凝胶的FT-IR图谱。PVA分子链上带有许多可反应羟基，环氧氯丙烷在碱性条件下可与羟基发生反应[15]。从图中可以看出，3 439、3 432、3 437 cm-1处分别为XG、PVA和XG/PVA复合水凝胶的羟基伸缩振动峰，是分子链上羟基存在分子间或分子内的氢键振动吸收造成的，说明通过冷冻-解冻循环可以使凝胶分子链间产生氢键等形成物理交联；1 110 cm-1处为醚键的吸收峰，可以看出在交联后，XG/PVA复合水凝胶有一个较宽的醚键吸收峰，说明反应可能有新的醚键生成，发生了化学交联[15-16]。可见，通过化学与物理交联作用，XG与PVA交联成功。

图3 XG/PVA水凝胶的SEM

图4 XG/PVA水凝胶的红外光谱图

2.5 XG/PVA水凝胶的pH敏感性

图5为pH值对XG/PVA复合水凝胶平衡溶胀的影响曲线。从图中可以看出，该凝胶在酸性及碱性环境中的溶胀率均高于中性条件下的溶胀率，这是因为在碱性环境中时，XG侧链中的-COOH基团去质子化，电离成-COO-使凝胶带有负电荷，电荷的相互排斥使凝胶内部结构疏松易于溶胀；在酸性环境中，XG中-COOH基团质子化，水凝胶中含有大量亲水基团，高分子链上的羟基被质子化而带正电荷，致使分子链间相互排斥，伸展结构，使凝胶表现出较大的溶胀率。表明了pH值的变化会造成该凝胶高分子链基团的质子化/去质子化的变化，使得链段的溶胀率平衡发生变化[2-3]。

图5 不同pH的XG/PVA水凝胶的平衡溶胀率

2.6 XG/PVA水凝胶的pH响应性

图6为XG/PVA水凝胶的溶胀-消溶胀曲线。从图中可以看出，XG/PVA水凝胶置于酸或碱pH缓冲液中2 h该凝胶溶胀率增加，取出置于pH=7.0的PBS中2 h溶胀率降低，在置于酸或碱pH缓冲液2 h后溶胀率又增加，如此交替浸泡呈现出一种“∧”的趋势。说明该凝胶对pH的改变具有一定的响应性，且其溶胀收缩过程可逆，在作为控制药物释放方面发挥出一定作用[17]。

图6 XG/PVA水凝胶的溶胀-消溶胀行为

2.7 不同pH下包埋BSA的水凝胶体外释放行为

图7为不同pH值对BSA体外释放的影响曲线。从图中可以看出，XG/PVA水凝胶在酸性条件下和碱性条件下的BSA体外累积释放率均高于中性条件下，可能是因为凝胶高分子链在强酸碱环境下呈舒展状态，伸展结构为BSA的扩散打开了通道。而在中性环境下呈卷曲状态，阻碍了BSA的释放通道[18-20]。表明了环境中pH值对BSA的释放具有明显的控制作用。

图7 不同pH的XG/PVA水凝胶的BSA体外释放

2.8 XG/PVA复合水凝胶的细胞相容性

将MG63细胞与XG/PVA复合水凝胶共培养，用荧光倒置显微镜观察材料周围细胞生长情况。从图8(a)中可以看出，4天时，大量梭形细胞在材料周围增殖生长，并可以保持良好的细胞形态。图8(b)则表明细胞与材料共培养时，细胞有明显的增殖，表明XG/PVA复合水凝胶具有良好的细胞相容性，可维持细胞正常生长增殖。

图8 XG/PVA水凝胶的细胞增殖实验

3 结论

本文利用化学交联结合物理交联制备出了pH敏感型XG/PVA复合水凝胶，研究了其溶胀性能、力学性能、pH响应性能、BSA体外释放性能及其生物相容性。

(1)当XG与PVA质量比为1 : 5时，交联剂用量为5%时，冷冻-解冻循环3次时XG/PVA水凝胶具有良好的溶胀性能和力学性能，溶胀率达到241%。压缩弹性模量和压缩强度分别达到(26.30±0.03)kPa和(134.36±0.43)kPa。

(2)通过SEM观察，XG/PVA复合水凝胶形成了互穿网络结构；从FT-IR结果表明XG与PVA形成了复合水凝胶。

(3)XG/PVA复合水凝胶具有良好的pH刺激响应性，对BSA的释放也表现出了良好的控制缓释效果，且细胞培养结果表明，该凝胶周围细胞生长良好，形态正常，表现出良好的细胞相容性，有望用于控制药物释放载体。