哺乳动物细胞CHO制备重组抗体关键技术研究进展

孙静静，王格，赵巧辉，李桂林

·综述·

哺乳动物细胞CHO制备重组抗体关键技术研究进展

孙静静，王格，赵巧辉，李桂林

450016 郑州伊美诺生物技术有限公司

哺乳动物细胞能够提供复杂的翻译后修饰，表达蛋白性质与天然蛋白接近，使蛋白药物更加稳定有效。自 1987 年 FDA 批准第一个中国新药组织型纤溶酶原激活剂（TPA），哺乳动物细胞广泛应用于重组蛋白的生产，开始了工业化生产之路。在生物制药行业几十年的快速发展中，哺乳动物 CHO 细胞成功生产了众多细胞因子、重组酶、重组抗体、重组融合蛋白等有价值的生物技术药物，为市场需求作出重大贡献，同时也奠定了它在生产细胞中的优势地位。抗体药物是现代生物医药产业的主力军，占全球生物药物市场的 50% 以上，是生物医药产业增长最快的细分领域，抗体药越来越多地应用于几乎所有的医学分支，抗体疗法的日益成功推动了重组抗体技术和生产设施的设计和管理。抗体药物自身有着不容忽视的问题，如结构复杂不稳定、大规模生产复制困难、研发周期长、生产成本高、工艺复杂等[1]。随着国内抗体药物的发展和应用，降低成本成为企业的主要任务，提高蛋白表达量是降低成本的主要手段之一。提高外源蛋白表达水平的方法很多：包括目的基因序列优化、分泌信号肽筛选、工艺流程相关参数优化、培养基优化及细胞株优化等。本文重点对哺乳动物细胞 CHO 重组抗体制备上游关键技术因素包含宿主细胞、载体、培养基、培养设备等进行综述，以期提供提升抗体表达量，降低成本的解决方案。

1 载体

CHO 细胞表达载体基本元件包括复制起点、启动子、poly A 加尾信号、筛选标记、多克隆位点等。启动子一般较多采用 SV40 和 CMV 两种，CMV 启动子通常位于目的基因之前，SV40 启动子位于筛选标记之前。目的基因在 CHO 细胞中的表达受基因拷贝数、转录水平、翻译水平及翻译后修饰的效率、目的基因整合的染色体区域状态和整合于宿主染色体的位置等诸多因素的影响，载体设计与优化对于提高目的蛋白的表达量十分重要[2]。

1.1 常用载体

1.1.1 单顺反子 早期进行稳定表达重组抗体构建时，将抗体的重链序列（HC）和轻链序列（LC）分别构建至两个单顺反子载体中，这种构建方法缺点较多：①耗时且较难表达；②筛选稳定株时需要 2 个不同的筛选标记；③整合进入宿主 DNA 的效率较低，影响表达。早期瞬时表达时常用单顺反子构建，便于快速表达，但表达量相对较低。由于轻链分子量较重链低，轻链表现出更高的转录和翻译效率，由于单顺反子的劣势较明显，较少使用进行大规模抗体的表达，需要进行多顺反子构建[3]。

1.1.2 多启动子表达载体 多启动子表达载体包含不同的启动子分别驱动 HC 和 LC 的转录和翻译。Bayat 等[4]比较了单启动子、双启动子和多启动子载体表达重组抗体，结果表明双启动子载体表达最高，但由于每个基因受不同的启动子驱动表达，会出现 HC 和 LC 表达失衡的情况，导致两个启动子相互干扰或抑制。在大部分情况，多启动子的容纳能力是受限的，很难容纳多于两个启动单元，因此多启动子载体构建应用也受限。

1.1.3 三顺反子载体 多顺反子载体可在 1 条 mRNA 同时表达 HC、LC 和筛选标记，抗体的表达量高、集聚度低且糖基化均一。目前广泛采用多顺反子表达方案，常利用内部核糖体进入位点（internal ribosome entry site，IRES）或自剪切多肽 2A（self-cleaving 2A peptide，2A）等元件来连接多个基因，实现在单个载体上表达多个多顺反子的目的。Yeo 等[5]利用 IRES 构建的三顺反子（图 1）在 CHO DG44 悬浮细胞进行表达，利用两个内部核糖体进入位点（IRES）在一个转录本中表达 LC、HC 和二氢叶酸还原酶（DHFR）选择标记基因。在此三顺反子载体中，三个基因受一个含有核心 CpG 岛元件（IE）的人巨细胞病毒（hCMV）启动子控制，可提高单抗的表达水平，减少聚集体产生。

图1 IRES 介导的三顺反子原理图

1.2 定点整合

外源基因的转录水平在很大程度上受其整合于宿主染色体位点的影响，这种现象称为位置效应。工业界目前普遍采用了基于目的基因随机整合构建表达细胞株的方法。定点整合（site-specific integration，SSI）可将基因整合至染色体的特定稳定热点位置，实现外源基因高表达。特异性重组酶系统为基因定点整合提供了可能，已有很多关于 Cre/loxP、Flp/FRT、Bxb1 和 phiC31/R4 等重组酶成功应用于外源基因定点整合的报道[6]。

2 CHO 细胞

2.1 宿主细胞种类

重组抗体/抗原表达最常用的宿主细胞有 CHO、NS0、Sp2/0、HEK293 和 PER.C6。其中 70% 工业化生产抗体药物选择 CHO 细胞进行制备[7]。迄今已有 1360 种重组抗体/蛋白药物选择 CHO 细胞作为宿主细胞，尤其是近10 年，有 467 种重组抗体/蛋白药物选择 CHO 细胞作为宿主细胞。CHO细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞，因为与其他系统相比，CHO 细胞具有以下优点：①对蛋白有准确的加工、修饰功能，其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；②耐受剪切力和渗透压的能力相对较强；③整合外源基因后的细胞稳定，重组基因能高效扩增和表达；④表达的目的蛋白可由细胞内运输到细胞外，并且 CHO 细胞只表达少量的内源蛋白，有利于目的蛋白的提取；⑤清晰的历史背景和监管机构的认可；⑥在无血清及化学限定培养基中快速稳健地悬浮生长。

CHO 细胞制备抗体药物工艺成熟，抗体表达量高，批式培养约可达 1 g/L，流加补料培养可达 1 ～ 15 g/L（1987 年CHO 稳定株表达量 0.1 g/L，2007 年 CHO 稳定株表达量 5 g/L，2015 年 CHO 稳定株表达量 10 g/L），单细胞分泌可达 10 ～ 90 pg/(cell·d)，如表 1 所示[8]。

CHO 细胞包含有CHO-DUXB11（或者 DUKX）、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-S，以及近年来受到持续关注的 GS 基因敲除的 CHO 细胞，如 Merck/Sigma Aldrich 公司的CHOZN，Lonza 的 CHO K1 SV/ GS-KO，Horizon 公司用 rAAV 技术敲除的 CHO 细胞，但它们都来源于共同的祖先，CHO 细胞发展历程如图 2 所示[9]。

Reinhart 等[10]比较了 CHO-K1（ATCC CCL-61）、CHO-DG44（Life Technologies）、CHO-S（Life Technologies）三种细胞表达同一株抗体，结果表明，使用同一培养基进行流加补料培养，CHO-DG44 表达量 670 mg/L，优于 CHO-K1 表达量 460 mg/L，优于 CHO-S 表达量 370 mg/L，进行灌流培养时，CHO-K1 表达量优于 CHO-DG44，CHO-DG44 优于 CHO-S，单细胞分泌量方面表现出了同样趋势，CHO-K1（13 ～ 16 pg/(cell·d) > CHO-DG44（4 ～ 5 pg/(cell·d) > CHO-S（2 pg/(cell·d)）。Reinhart 等[11]分别用两种培养基培养表达同一抗体的 CHO-K1、CHO-S 和 CHO-DG44 细胞，结果表明使用 ActiCHO P（GE Healthcare），表达量方面 CHO-DG44 表达量优于 CHO-K1，也优于 CHO-S；但是使用 CD CHO（Life Technologies）培养基，表达量方面CHO-K1 细胞优于 CHO-S 细胞，优于 CHO-DG44 细胞，结果表明培养基对抗体表达量有 5 ～ 6 倍的影响。Rajendra 等[12]研究表明使用 PiggyBac 转座子进行重组抗体细胞池构建筛选，细胞池表达量达 7.6 g/L，较对照高 2 ～ 10 倍，细胞池培养从摇瓶到 36 L 生物反应器放大，产品质量表现出较高的一致性，结果表明 piggyBac CHO 细胞池快速生产克级的治疗性蛋白质。

表1 CHO 细胞株表达量比较

注：n.a. 代表未获得数据。

图2 CHO 细胞常见细胞系

2.2 细胞系稳定性

细胞系和工艺稳定性对生物制药的生产具有重要意义，多年来保证产品的高质量是生物制药生产的最重要原则。关于细胞系的稳定性，分为几类：①理想型：CHO 细胞进行 100 次倍增周期结束时，蛋白表达量降低小于 15%；②稳定型：CHO 细胞进行 60 次倍增周期后，细胞的蛋白表达水平维持在可接受范围内；③逐渐丧失型：CHO 细胞进行少于 60 次倍增周期，细胞的蛋白表达水平在多次传代中显示出可测量的降低或逐渐降低的趋势；④突然降低型：细胞经历某次传代后，细胞的蛋白表达水平突然降低。统计数据表明有 8% ～ 63% 的细胞株存在不稳定现象[13]，导致 CHO 细胞不稳定性的原因主要有 CHO 基因组的固有不稳定性、转录沉默、基因/表型漂移等[14]。

2.3 细胞株改造

2.3.1 抗凋亡改造 细胞凋亡是影响活细胞密度和产量、质量的关键因素。引起细胞凋亡的因素很多，如营养物质消耗、代谢废物累积、不断增加的渗透压以及剪切力等。细胞凋亡受 Bcl-2 家族蛋白调节，包含抗凋亡 Bcl-2 样蛋白（Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Mcl-2）和促凋亡蛋白（Bax、Bak、Bok、Bim、Bid、Bad、Puma 和 Noxa）。过表达抗凋亡因子 Bcl-2 样蛋白可延长培养时间，对 Qp 影响不明确，差异性主要是由于克隆多样性[15]。过表达凋亡因子 Bcl-2 样蛋白同时加强 Qp 增长因子，如丁酸钠、高渗透压等，可明显提升 CHO 细胞的外源蛋白表达[16]。

2.3.2 抗细胞自噬改造 细胞自噬，也被称为 I 型程序性细胞死亡（program cell death，PCD)，是溶酶体介导的降解途径中的一种代谢，与细胞凋亡（II 型 PCD）不同。有研究表明，在 CHO 细胞批式培养营养物质耗尽时，出现由于细胞自噬导致的细胞死亡[17]。另外流加培养过程中通过添加补料和 pH 控制可以诱导细胞凋亡和自噬，过表达 Bcl-xL 可以延缓由于细胞自噬导致的细胞死亡[18]。

2.3.3 细胞增殖改造 改造 CHO 细胞生长相关蛋白可以提高细胞生长速率或者最大细胞密度。通过调节改造与细胞生长周期相关的细胞周期蛋白依赖性激酶 3、细胞周期蛋白 E、细胞周期转录因子 E2F1 可提升细胞生长速率或者最大细胞密度[19]。典型的致癌蛋白 c-myc在细胞周期中发挥重要作用，雷帕霉素在哺乳动物细胞的翻译、囊泡运输、细胞分化等方面发挥着不同的作用，成功用于 CHO 细胞改造，提高细胞密度[20-21]。

2.3.4 代谢改造 CHO 细胞中氨和乳酸的积累是一个主要问题，对细胞生长和产品质量有重要影响，这两种有毒废物是由能量来源谷氨酰胺和葡萄糖产生。对代谢相关蛋白进行基因修饰可高效利用代谢物，如使用氨生成较少的底物谷氨酸可减少谷氨酰胺转化为氨，CHO 细胞表达谷氨酰胺合成酶（GS），GS 催化谷氨酸与氨反应生成谷氨酰胺，结果代谢废物氨的累积变少，同样将尿素循环中的氨甲酰磷酸合成酶 I 和鸟氨酸转氨酰酶引入 CHO 细胞，也可导致氨积累减少[22]。

有多种方法可以稳定地从基因组中删除基因或关闭其功能，如通过化学或辐射诱导随机突变，或使用精确的基因组编辑方法。目前最新基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（ZFNs）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）、巨核酸酶、簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）系统和 RNAi 介导基因沉默[23]。

3 培养基

细胞培养基含有相似的基础营养组分，支持细胞增殖，包括水、碳酸、氮源、磷酸盐、氨基酸、脂肪酸、维生素、微量元素、无机盐和其他满足细胞生长需求的营养物质。合适浓度的营养物质可以使细胞维持在需求的细胞密度，监测营养物质代谢速度可以进行补料以维持细胞持续增长。培养基种类多样，现重点关注无血清、化学成分限定的、适合工业化生产的 CHO 培养基。培养基优化是提升表达量的其中一个关键因素，Huang 等[24]分别选择 3 种基础培养基（CM1、CM2、CM3）和 4 种补料培养基（CF1、CF2、CF2a、CF2b），培养 CHO DG44 细胞表达人 IgG 抗体，结果表明使用 CM3 培养基和 CF2b 补料表达量最高达 9800 mg/L，较使用 CM1 培养基和 CF1 补料表达量提升 2.3 倍。

3.1 能源物质

葡萄糖是最主要的碳源和能源物质，培养基中剩余约 0.5 g/L 葡萄糖时，细胞仍可维持较好的活率，但是由于 CHO 细胞的增殖速度和营养消耗速率较快，在培养过程中葡萄糖的浓度最低要控制在 2 ～ 3 g/L。葡萄糖的消耗会造成丙酮酸和乳酸的累积，高浓度的乳酸会抑制细胞的生长。半乳糖是一种重要的葡萄糖替代物，当培养基中含有葡萄糖和半乳糖时，细胞优先消耗葡萄糖，之后转变消耗半乳糖，可以减少乳酸堆积，进而延迟细胞活率降低[25]。

谷氨酰胺也是一种常用的能源物质，谷氨酰胺的缺乏会延迟细胞对数期的启动[26]。培养基中添加谷氨酰胺，可提升细胞活率、降低乳酸代谢，但是谷氨酰胺代谢产生氨，高浓度的氨影响细胞生长和其他氨基酸的代谢[27]。因此常用谷氨酰胺聚合物 GlutaMAX（Thermo）替代谷氨酰胺，谷氨酸和丙酮酸也可替代谷氨酰胺[28]，减少氨的产生。

3.2 氨基酸

氨基酸是细胞培养的基础组分，研究表明优化培养基中氨基酸的种类及浓度，可以影响细胞生长和蛋白分泌，影响抗体糖基化，可以使细胞密度提升 50%，融合蛋白分泌提升 25%[29]。依据细胞的代谢特点，应用 Plackett-Burman 实验方法进行培养基中氨基酸浓度的优化，确定利于细胞生长和蛋白分泌的关键氨基酸，使抗体分泌提升，但不影响抗体的质量。

3.3 脂质

脂类是生物膜的主要成分，可作为哺乳动物细胞能量来源和信号分子，是内质网和高尔基体的关键组成部分。CHO 细胞自身可合成脂质，但若在无血清培养基中补充脂质，更有利于对细胞活力维持和产物糖基化。不同脂质及脂质前体对 CHO 细胞生长的影响有很大的不同，培养基中脂质补充剂的选择对细胞生长可产生显著影响[30]。

磷脂是大多数哺乳动物细胞膜的主要成分，补充外源性磷脂，如磷脂酸和溶血磷脂酸，可能刺激化学成分限定无血清培养中 CHO 细胞生长。外源性补充剂乙醇胺对细胞生长有促进作用，效果与混合脂质相当[31]。脂肪酸和胆固醇在水中不易溶解或不稳定，脂肪酸和胆固醇前体和类似物，更稳定且更易溶解在培养基中，同样可促进细胞生长。脂肪酸在培养基中发挥重要作用，培养基中的含量应保持在相对较低的水平，因为高浓度的脂肪酸可能导致 CHO 细胞的脂毒性[32]。

3.4 维生素

维生素作为辅酶或辅助因子信号，在信号级联反应以及酶的抑制和激活中发挥重要作用。维生素的高还原能力可以保护细胞免受氧化损伤。化学成分限定的培养基，都含有多种维生素及其衍生物，包括生物素、叶酸、肌醇、烟酰胺、胆碱、4-氨基苯甲酸、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素和钴胺素。研究表明在CHO 细胞培养中添加维生素，单抗产率提高 3 倍。多种维生素对热、强光和长期暴露在空气中敏感，尤其是 CHO 培养基中常添加的维生素，抗坏血酸和生育酚易被空气氧化，硫胺素、核黄素、钴胺素和抗坏血酸对光敏感；硫胺和泛酸对热敏感，需要对光和热进行保护，因此在培养基储存期间，避光和低温至关重要[33]。

3.5 微量元素

细胞培养基中微量元素的有效浓度通常非常低，甚至低于标准分析仪器的检测阈值。然而它们发挥着重要作用，许多微量金属元素对代谢途径的调节以及某些酶信号的活性起着关键作用。在 CHO 细胞培养中，铜缺乏可导致乳酸脱氢酶和其他线粒体酶下调，进而导致组织毒性；相对较高浓度的铜可以改变 CHO 细胞乳酸代谢，从乳酸产生到乳酸消耗，促进细胞生长和产量，因此 CHO 细胞培养基中的铜浓度应根据培养表现和产品质量进行调节[34-35]。铁被广泛认为是化学成分限定培养基中的必要成分。铁通过血红素、线粒体氧化途径在氧转移中起着关键作用[36]。在无血清培养基中，可添加重组转铁蛋白以提高铁的稳定性和摄取。小分子螯合剂如肌钙酮、柠檬酸盐和亚硒酸盐，可作为转铁蛋白的廉价替代品。亚硒酸盐、铁和柠檬酸盐在最佳浓度配比下，可提高铁的吸收，促进 CHO 细胞在缺铁培养基中生长，若只有柠檬酸铁而无亚硒酸盐时，不能达到同样效果。在化学成分限定和无蛋白 CHO 细胞培养基中，锌是对单抗产量影响最大的微量元素之一，培养基中补锌可使单克隆抗体产量提高 1.2 倍[37]。

除上述主要微量元素外，其他元素也会影响细胞生长和产品产量。在细胞培养基中，大多数微量元素浓度低于5 μmol/L。大多数培养基中都含有锰、钼、硒和钒等常规细胞所需微量元素。其他微量元素，包括锗、铷、锆、钴、镍、锡和铬等，在部分哺乳动物细胞培养基中也会添加。

3.6 无机盐

无机盐在 CHO 细胞培养基中起着重要的化学和生物学作用，包括维持细胞膜电位、渗透压和缓冲作用，无机盐离子包括钠、钾、镁、钙、氯化物、磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐和铁硝酸盐。常规 CHO 细胞培养基中，钠离子与钾离子的比值范围为 20:1 ～ 40:1，也有报道钠钾比较低（6:1 ～ 8:1）的培养基或相对较高的钾浓度有利于提高 CHO 细胞生长能力和分泌能力[38]。培养基中钙和镁离子的浓度通常为 1 ～ 3 mmol/L 和 0.2 ～ 1 mmol/L。缺乏钙和镁会触发细胞凋亡，而细胞内钙离子浓度过高也可能导致细胞凋亡[39]。

无机盐还可以控制培养基的渗透压。Ozturk 和 Palsson[40]报道将渗透压从 290 增加到 435 mOsm/kg，会降低杂交瘤细胞系的细胞生长，但细胞比增殖率增加了两倍以上，从而产生类似的最终抗体浓度。据报道，CHO 细胞渗透压在 316 ～ 450 mOsm/kg 之间，细胞比生长速率随着培养基渗透压的增加而线性下降，渗透压逐渐增加至 450 mOsm/kg 左右，可显著提高 CHO 细胞过程中的比分泌速率和抗体产量[41]。

3.7 聚胺

聚胺是哺乳动物细胞中普遍存在的分子，在 DNA 合成和转录、核糖体功能、离子通道调节和细胞信号传导等多种代谢过程中发挥着关键作用，CHO 培养基含有外源性多胺，包括腐胺、亚精胺、精胺。腐胺是合成精胺和亚精胺的前体，而精胺和亚精胺在细胞中可以相互转换。以前的研究表明，这些聚胺中的每一种都可以单独提高细胞的生长速度和活力，精胺是最有效的[42]。多胺可通过多种途径分解代谢产生氧化物种、醛类、丙烯醛和氨，从而抑制细胞生长并最终影响细胞活力，因此在细胞培养基中补充多胺应控制在细胞毒性限度以下。

3.8 非营养成分

CHO 细胞培养基中存在一些非营养成分，给细胞提供更稳定的物理或化学环境，如缓冲剂、表面活性剂和消泡剂。缓冲液是细胞培养的重要组成部分。CHO 细胞培养基中可添加有机两性离子缓冲液 HEPE 等，在 7.2 ～ 7.4 的 pH 范围内提供强大的缓冲能力，提高 pH 稳定性。此外培养基中的磷酸盐离子也是提供缓冲能力的主要来源。

Pluronic F-68 是培养基中常用的一种表面活性剂，可以保护细胞免受泡沫破裂、机械搅拌等引起的损伤。Pluronic F-68 可通过一种或多种机制保护细胞，包括在细胞膜上形成保护层，从而降低疏水性，稳定生物反应器中细胞培养物顶部的泡沫层，或通过并入细胞膜加强细胞膜稳定性。消泡剂是一种疏水性很强的表面活性剂，其表面黏度很低，保护细胞免受机械剪切，并防止生物反应器和排气过滤器堵塞时潜在的泡沫堆积。消泡剂可直接添加到生产培养基中或在生产过程中按需添加。消泡剂可以是油基或有机硅基，根据消泡机制可分为快消泡剂和慢消泡剂。快消泡剂通常是水悬浮液或乳状液，其中乳状液中的颗粒或液滴快速进入泡沫膜以破泡；油基消泡剂消除泡沫作用更慢。在 CHO 细胞培养中多使用硅酮基消泡剂，如消泡剂 C，因硅酮基消泡效率高、毒性小而得到广泛应用[43]。

4 细胞培养设备和工艺

哺乳动物细胞悬浮培养的设计依据主要依赖于搅拌生物反应器，自 20 世纪 80 年代建立搅拌式 CHO 生物反应器技术以来，生物反应器的设计更注重向工业化、自动化和智能化方向发展。培养工艺以补料分批培养和灌注培养最常见。补料策略可以通过一个或多个补料溶液从单次到多次变化，补料成分包括营养浓缩物、葡萄糖、微量元素和维生素或其他培养基组分。这种生产方式工艺简单、设计灵活、易于扩展和转移，且便于优化产品产量和质量参数，成为当今生物技术行业的主力军，同时涌现了多个生产外包组织（contact manufacture organization，CMO）。灌流培养的优势是高容量输出，因为典型的较高细胞密度和较短的产品停留时间使得灌流培养技术对敏感产品特别有吸引力，例如凝血因子或其他易被蛋白水解或其他易降解不稳定的蛋白质[44]；对于相对稳定的产品，分批补料处理已成为工业规模的主流生产技术。

哺乳动物细胞生产生物反应器的大小从数百升到25 000 L 不等，取决于临床供应需求，商业和工业所需的生产规模，用于工艺开发、表征和验证研究的小型实验室生物反应器的体积通常为 2 ～ 5 L。这 10 000 倍的放大比例是传统搅拌生物反应器的关键优势，能够有效地测试包括复杂的统计设计实验在内的许多实验条件，放大/缩小模型原则现在已经很成熟，许多公司已经将多个流程从小型临床转移到大型工业设施[45]。生物反应器现常用一次性生物反应器，其生产规模可达 2000 L，但它较难达到许多常见的大型工业化设备的容量（如 25 000 L），常用于临床或小规模（通常是单一产品）商业生产。Xing 等[46]认为放大过程中混合时间、氧传质和二氧化碳去除等因素至关重要，与 5 L 和 20 L 等实验室反应器相比，5000 L生物反应器具有较低的氧传递系数、较长的混合时间和较低的二氧化碳去除率，提高底部空气喷射率比增加输入功率更有利于氧的传递和二氧化碳的去除。在 5000 L 反应器放大的过程中，混合时间和二氧化碳去除相关的工艺参数需要优化，以降低工艺规模放大过程的风险。Clincke 等[47]使用一次性 wave 反应器比较了“经典”切向流过滤（TFF）和交替切向流系统（ATF）设备灌流培养 CHO 细胞，培养周期 20 d，最大细胞密度可达到 2.14 × 108个/ml，使用 TFF 时细胞密度受到中空膜容量和 pCO2水平的限制，使用 ATF 时由于泵容量限制无法拉动高黏度液体，整体 TFF 系统可以达到更高的细胞密度。TFF 入口压力与黏度高度相关，据此建立了压力模型，为 TFF 和 ATF 的中空纤维灌流方案设计提供了有用的工具，培养工艺受黏度等物理限制较大，根据对目前模型分析，建议灌流培养细胞密度应低于 1.46 × 108个/ml。

5 展望

全球抗体药物发展迅速，市场规模巨大，中国抗体药物行业面临很好的时机，包括国家政策支持、药监局改革，还有巨大的市场潜力。中国企业也投入大量资金进行研发，工业化哺乳动物细胞培养技术已经发展到一个成熟的阶段，分批补料工艺生产规模高达 25 000 L，表达量≥ 10 g/L。如何快速研发、提高产量、降低成本仍是企业亟需关注解决的问题，从而为抗体药的未来发展提供更多空间。

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赵巧辉，Email：zhaoqiaohui@autobio.com.cn

2021-02-22

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.04.010