超高压提取黄精多糖及提高运动耐力机制

张士凯 王 敏 程欣欣 张启月 吴 澎

(山东农业大学食品科学与工程学院/山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东 泰安 271018)

黄精(Polygonatum sibiricum)是百合科黄精属(Polygonatum)多年生草本植物，为中华名药之一，多生于山坡背阳处、灌木丛中及树荫下，其茎柔长，叶呈线针状，略卷曲，五枚轮生，花开夏季，为白色或淡黄色，成熟时呈紫黑色，根茎横生，可药食两用。其中多糖是黄精中主要的活性成分之一，具有降血压、降血脂、延缓衰老、改善心脑血管功能和预防肿瘤等功效[1－3]。

目前提取黄精多糖常用的方法有热水浸提法、酸碱提取法、酶法提取等[4]。传统的提取方式耗能高、周期长、工序复杂，会破坏小分子活性成分。超高压提取技术为非热技术，具有快速、短时、节能、操作简单、高效等优势，不会对热敏性及小分子活性物质造成破坏[5]，为食品领域科学研究、天然物质提取及工艺革新提供了新的思路。

机体在进行高强度或长时间运动时，会引起身体疲劳与不适，影响机体运动能力，导致工作效率低下[6]。研究表明，黄精具有抗氧化、缓解运动疲劳等功效，杨华杰等[7]比较了不同炮制黄精提取液的抗疲劳作用，结果表明，黄精各炮制品提取液均具备显著的抗疲劳作用；马怀芬等[8]以人参皂苷为阳性对照，通过小鼠游泳时间及肝糖原含量验证了黄精提取液的抗疲劳能力；陈靓雯等[9]通过对比灌胃黄精粗提物前后小鼠游泳时间、血清尿素氮、肝糖原、血乳酸水平的变化，发现黄精粗提物具有一定抗疲劳功效。关于黄精抗疲劳功效的研究并不缺少[10]，但是缺乏对其机制的深入了解与全面分析。

本试验采用超高压技术提取炮制黄精多糖(processing of polygonatum polysaccharide，PPP)，利用响应面法优化提取工艺，并以优化提取的PPP 为原料，通过小鼠力竭游泳时间及血清、肝脏、腓肠肌中相关酶指标变化验证PPP 提高运动耐力的能力，并对其机制进行推测，以期为PPP 提高运动耐力的研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄精，取样于山东泰安徂徕山地区；SPF 级昆明(KM) 种雄性小鼠[许可证编号: SYXK (鲁)20170023]，四周龄，体重19～26 g，购于山东朋悦实验动物繁殖有限公司；乳酸(lactic acid，Lac)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、血清尿素氮(serum urea nitrogen，SUN)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、ATP 酶、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)等试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

SpectraMax M5 多功能酶标仪，丹麦BioPorto 公司；HPP600MPA/3－5L 超高压设备，包头科发高压科技有限责任公司；5810/5810R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；UV-VIS-NIR 紫外－可见分光光度计，美国Varian 公司。

1.3 黄精炮制

采用张伟娜等[11]描述的九蒸九晒方法对黄精进行炮制。

1.4 黄精多糖提取与优化

1.4.1 单因素试验 采用水提醇沉法提取粗多糖[12]。将炮制黄精烘干制粉过60 目筛后备用。取黄精粉1.0 g，分别按液料比5、10、15、20、30 mL·g－1，保压时间5 min，压强200 MPa 进行提取；取黄精粉1.0 g，分别设保压时间1、4、7、10、13 min，液料比20 mL·g－1，压强200 MPa 进行提取；取黄精粉1.0 g，分别设压强100、200、300、400、500 MPa，液料比20 mL·g－1，保压时间7 min 进行提取，然后将浸提液于6 500 r·min－1离心10 min，取上清，旋转蒸发浓缩，以减小溶液体积，加入4 倍体积96%(v/v)乙醇醇沉过夜，离心弃上清，依次用无水乙醇、丙酮和乙醚洗涤沉淀各3 次，得PPP，按公式(1)计算PPP 得率[13]，得最佳单因素。绘制葡萄糖标准曲线为y＝6.823 6x－0.042 3(R2＝0.999 3)，用以计算多糖浓度。

1.4.2 响应面优化试验 在单因素试验结果基础上，以PPP 得率为响应值，探究液料比、压强、保压时间3个因素对PPP 得率的影响，根据Box-Behnken 试验设计原理，采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件进行3 因素3 水平响应面优化试验[14]，得最佳提取工艺，同时以相同工艺对生黄精进行处理用作对照进行后续动物试验。

1.5 PPP 提高小鼠运动耐力试验

1.5.1 试验动物分组及试验设计 取50 只SPF 级KM 雄性小鼠，先适应性饲养3 d，然后随机分为5 组:PPP 高剂量组(1 600 mg·kg－1BW)、中剂量组(800 mg·kg－1BW)、 低剂量组(400 mg·kg－1BW)、空白对照组(0.9%生理盐水)及生黄精提取物组(1 600 mg·kg－1BW)，连续灌胃19 d，灌胃量为每只0.5 mL·d－1，灌胃期间隔日对小鼠进行称重，统计进食量，试验期间自由饮水[15]。

1.5.2 小鼠负重游泳试验 灌胃期间进行4 次适应性游泳训练，前3 次分别无负重游泳10、20 和30 min，第4 次负重(体重量1%铅丝)游泳30 min，末次灌胃30 min 后，使小鼠尾部负重(体重量2%铅丝)于水深30 cm 游泳箱中进行力竭试验，水温保持在25±1℃，记录力竭游泳时间(头部沉入水中6 s 不能浮上水面[16])。

1.6 PPP 提高小鼠运动耐力机制初探

1.6.1 动物分组及试验设计 取30 只SPF 级KM 雄性小鼠，分为3 组:空白对照组(0.9%生理盐水)、空白游泳 组(0.9%生理盐水)、 PPP游泳组(800 mg·kg－1BW，最优剂量)，连续灌胃19 d，灌胃量为每只0.5 mL·d－1，灌胃期间进行3 次适应性游泳训练(同1.5.2)，末次灌胃30 min 后，将空白游泳组与PPP 游泳组于水深30 cm 游泳箱中负重(体重量2%铅丝)游泳40 min，水温保持在25±1℃，游泳结束后，立即对3组小鼠断头取血，解剖取肝脏、左腿腓肠肌，立即于－80℃冰箱保存[17]。

1.6.2 血清、肝脏和肌肉组织匀浆、线粒体制备 血清制备:小鼠断头取血后立即于3 500 r·min－1、4℃离心15 min，取上清即为血清，4℃保存[18]。

组织匀浆制备:取组织块(0.2～1 g)用冰冷生理盐水漂洗除去血液，然后加入10 倍生理盐水，用眼科剪将组织剪碎，倒入玻璃匀浆管中进行匀浆，充分研碎，使其组织匀浆化[19]。

线粒体提取:取10%组织匀浆于2 000 r·min－1离心10 min，取上清，9 500 r·min－1离心15 min，沉淀即为线粒体[20]。

1.6.3 疲劳相关指标的测定 分别测定3 组小鼠血清SUN、Lac 含量和LDH、T-SOD 活性，肝脏MDA 含量，左腿腓肠肌线粒体CK、ATP 酶活性等指标，按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行各指标测定。

1.7 数据统计分析

采用IBM SPSS statistics 24 软件与Design-Expert.V8.0.6.1 进行数据分析，采用Origin 9.1 软件绘图。

2 结果与分析

2.1 超高压提取PPP 工艺优化

2.1.1 响应面设计结果 通过试验确定其在每一个单因素条件下的最佳参数，分别为液料比20 mL·g－1，压强300 MPa，保压时间7 min。

采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件，在最佳单因素试验结果基础上，以PPP 得率为指标，根据Box-Behnken 试验设计原理进行3 因素3 水平响应面优化试验，共计17 组(表1)

表1 Box-Behnken 试验设计及结果Table 1 Box-Behnken test design and results

2.1.2 模型方程的建立分析及验证 采用Design-Expert.V8.0.6.1 软件对结果进行方差分析，将数据进行多元回归拟合，得到PPP 得率(R)与压强(C)、保压时间(B)、液料比(A)的二次响应面回归方程为:R＝13.42＋0.36A－0.26B－0.25C＋0.10AB＋0.075BC－1.71A2－1.51B2－1.79C2，式中各项系数的绝对值表示单因素对水解度参数的影响程度，正负反映影响方向[21]。对模型进行方差分析可知(表2)，此模型P<0.000 1，表明回归模型达到极显著水平；失拟项P>0.05，不显著，表明此模型拟合度良好，能较好解释响应中的变异；模型回归系数R2＝0.985 4，＝0.966 7，说明此模型对试验拟合度好，误差小，能解释96.67%响应值的变化，可以较好地预测超高压提取PPP 的工艺参数，可以用此模型进行分析和预测[22]。

表2 回归方程模型方差分析Table 2 Analysis of Variance of Regression Equation Model

图1 可直观反映各因素之间的交互作用，PPP 得率随着液料比、保压时间、压强的增加呈先上升后下降趋势，具有极大值。根据响应面分析结果，得到最佳PPP 得率为13.46%，对应的各最佳因素条件分别为:液料比23 mL·g－1、保压时间6.73 min、压强293 MPa。

为检验预测模型的有效性，在最佳工艺条件下进行3 次平行试验，PPP 的提取率为13.12%，与模型预测值(13.46%)无显著差异，证实拟合的响应面模型具有良好的预测性，可用来预测黄精多糖提取率。在此工艺条件下提取的多糖浓度为58.19%，此外，未经炮制的生黄精提取的多糖浓度为61.12%。

2.2 PPP 抗疲劳功能研究

2.2.1 试验期间小鼠体重及摄食量变化 在试验期间，小鼠生长正常，个别小鼠灌胃后反应迟钝，腹部胀气，可能是一次性灌胃量过大引起，无死亡情况发生，灌胃30 min 后均活动灵敏。每隔1 d 记录小鼠体重与摄食量变化，发现各组小鼠体重变化情况无显著差异(P>0.05)(图2)，19 d 摄食量也相近，无显著差异(P>0.05)(表3)，说明灌胃PPP 对小鼠体重增长和摄食量无明显影响。

表3 小鼠进食量变化Table 3 Changes in mouse food intake

2.2.2 小鼠力竭试验结果 疲劳最直接的表现为运动耐力下降。本试验通过测定小鼠力竭游泳时间判断PPP 抗疲劳的功效，并比较不同浓度PPP 对游泳小鼠耐力提升表现。由图3 可知，PPP 中剂量(163.57 min)和高剂量组(157.86 min)小鼠力竭游泳时间显著高于空白对照组(114.43 min)；与空白对照组相比，低剂量组(127.17 min)与生黄精提取物组(119.91 min)小鼠力竭游泳时间略有提高，但并无统计学差异(P>0.05)，表明PPP 可提高小鼠运动耐力，具有一定抗疲劳功效。且PPP 抗疲劳效果比生黄精多糖效果更好，可能是在炮制过程中多糖内部结构或组成发生了微妙变化，从而赋予其更多的生物活性功能。

2.3 PPP 提高运动耐力机制初探

2.3.1 小鼠血清生化指标变化 机体在剧烈运动时会产生大量Lac，使机体内pH 值降低，Lac 的大量聚集会破坏机体酸碱平衡，进而引起疲劳。SUN 是与疲劳相关的血液生化指标之一，是蛋白质和氨基酸的代谢产物，也是衡量机体承受体力负荷时的灵敏指标，机体对运动耐力的适应能力越差，SUN 的增加就越明显[23－24]。由表4 可知，与空白对照相比，小鼠游泳后，其血清Lac 含量、 LDH活性与SUN 含量显著升高(P<0.05)，T-SOD活性略有上升，但无显著差异(P>0.05)；PPP 游泳组与空白游泳组相比，小鼠血清Lac、SUN 含量显著降低(P<0.05)，表明PPP 可有效减少小鼠体内Lac、SUN 的产生。推测PPP 是通过增加糖原贮备，减少运动过程中Lac 的产生和蛋白质的分解，提高机体抗氧化、减轻运动应激损伤等途径达到提高运动耐力的功效。

表4 小鼠血清生化指标Table 4 Determination of serum biochemical indicators in mice

2.3.2 小鼠肝脏MDA 含量变化 MDA 是一种膜质过氧化产物，其含量可间接反映机体的损伤程度[25]。由图4 可知，相比于空白对照组(4.80 nmol·mL－1)，空白游泳组(6.69 nmol·mL－1)与PPP 游泳组小鼠肝脏MDA 含量均显著升高(P<0.05)；PPP 游泳组小鼠肝脏MDA 含量低于空白游泳组。表明小鼠经剧烈运动后，体内细胞氧化应激加强，出现一定损伤，推测PPP 是通过减轻机体运动过程中的氧化应激损伤，降低脂质过氧化程度从而达到提高运动耐力的效果。

2.3.3 小鼠腓肠肌线粒体生化指标变化 机体的运动离不开ATP 酶。ATP 酶能将ATP 催化水解，释放能量。肌肉活动中起主要作用的ATP 酶有3 种:Na＋K＋-ATP、Ca2＋Mg2＋-ATP 与肌球蛋白ATP 酶。ATP酶活性可以反映机体能量代谢水平。CK 主要存在于细胞质和线粒体中，可通过催化ATP 释放能量参与机体活动。机体强烈运动时，细胞膜在牵拉、震荡、自由基攻击等作用下膜通透性发生改变，导致CK 外渗至血液[26－27]。由表5 可知，与空白对照组相比，空白游泳组腓肠肌线粒体CK 活性显著降低(P<0.05)，而PPP 游泳组小鼠腓肠肌线粒体CK 活性较空白游泳组显著提高；游泳组小鼠腓肠肌线粒体Na＋K＋-ATP 与Ca2＋Mg2＋-ATP 活性下降，其中PPP 游泳组Na＋K＋-ATP与Ca2＋Mg2＋-ATP 活性较空白游泳组稍有上升，但均不显著(P>0.05)。推测PPP 可通过防止细胞膜受损而保护腓肠肌线粒体功能，减少线粒体的应激损伤，对腓肠肌能量代谢产生一定的改善，增强运动过程中能量供给，有利于机体运动耐力的保持与加强，通过改善线粒体代谢功能增加机体运动耐力，可能是PPP 具有缓解运动疲劳的重要机制。

表5 小鼠腓肠肌线粒体生化指标Table 5 Determination of mitochondrial biochemical markers in mouse skeletal muscle

3 讨论

传统的多糖提取方法一般采用高温、强酸、强碱的条件，所得废液易对环境造成破坏。超高压提取技术避免了强酸/碱溶液的使用，具有低温、低耗等优势，对样品活性成分影响小，为黄精功能性成分的分离及开发提供了新思路。本研究通过响应面优化试验得到PPP 最佳提取工艺为:液料比23 mL·g－1、保压时间6.73 min，压强293 MPa，在此条件下PPP 得率为13.46%。李丽等[28]利用水提醇沉工艺所得黄精多糖最佳得率为8.295%；魏炜等[29]采用超高压提取黄精多糖，得到其最佳得率为19.83%。不同研究中黄精多糖提取率存在一定的差异，这可能与黄精品种和提取工艺的不同以及是否炮制有关。已有研究表明，2种提取技术的协同使用会提高产品得率与品质[30]。建议后续开展超高压与酶、超声波、微波辅助等技术协同提取PPP 的研究。

机体高强度运动后会产生过多自由基，从而影响机体的运动功能。本研究通过小鼠力竭游泳试验证实PPP 具有提高运动耐力的功效，这与杨华杰等[7]和马怀芬等[8]对黄精和黄精提取液的抗疲劳研究结果一致。本研究还发现，与空白游泳组相比，PPP 游泳组小鼠血清Lac 和SUN 含量显著降低，T-SOD 活性上升，肝脏MDA 活性下降，腓肠肌线粒体中CK 和Ca2＋Mg2＋-ATP 活性上升，Na＋K＋-ATP 活性不变。推测其功能机制为，PPP 可提高小鼠抗氧化能力，增加糖原储存，减少蛋白质分解，使机体在运动过程中减少Lac、SUN 等代谢产物的产生，同时提高腓肠肌能量代谢能力，降低运动过程中线粒体的应激损伤，进而达到提高运动耐力的能力。这与陈靓雯等[9]通过小鼠力竭游泳时间及游泳前后其血清SUN 和Lac 水平对比研究黄精提取液抗疲劳机制的结果相一致。但本研究并没有确定是哪种成分起作用，也未进一步综合分析抗疲劳机制研究，因此，可结合生物医学、生物分子学等多领域学科深入分析PPP 抗疲劳的机制。

4 结论

本研究对超高压提取PPP 工艺进行了优化，得到最佳工艺条件:液料比23 mL·g－1、保压时间6.73 min，压强293 MPa。此外，超高压提取的PPP 能够显著延长小鼠力竭游泳时长，具有较好的提高运动耐力的效果，其可能是通过提高机体代谢与抗氧化能力，减少腓肠肌线粒体应激损伤实现的。