基于核酸适配体检测饲料中黄曲霉毒素B1的方法

彭臻菲，李泳宁，黄 慧，陈雅婷，林殿霞

(福建卫生职业技术学院， 福建 福州 350101)

0 引言

【研究意义】食品、农产品、饲料发霉变质是一个全球性的严重问题，其产生的霉菌毒素危害极大，对人和动物具有很强的毒性作用。霉菌毒素是由霉菌产生的有毒次级代谢产物，已知的霉菌毒素约有300种，黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，是一族结构相似、毒性极强的化合物，其中黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)的毒性最强，具有强致畸、致突变、致癌作用[1-3]，因此黄曲霉毒素引起的污染问题越来越受到人们的关注，而建立快速、灵敏的检测方法是确保食品和农产品安全使用的重要保障。【前人研究进展】目前，对AFB1的分析检测方法已有大量研究，主要有薄层层析法[4]、高效液相色谱法[5]、酶联免疫法[6]、液质联用法[7]和生物传感器法[8]等，这些方法均能实现对AFB1的定量和定性分析，但更方便、快速、准确的检测方法仍是目前研究的热点。【研究切入点】近年来，快速发展的基于核酸适配体的检测技术由于其灵敏度高和特异性强，成为国内外研究的重点。核酸适配体和抗体一样具有高度特异性和亲和力，已广泛应用于抗生素[9]、霉菌毒素[10]、蛋白质[11]及整个细胞[12]的检测。【拟解决的关键问题】利用与AFB1具有高特异性结合的核酸适配体末端标记荧光，其与AFB1特异性结合后空间构象的改变，与偶联BHQ1的互补序列无法配对，导致荧光值变化而实现对饲料中AFB1的快速、简便、高灵敏度检测与分析。

1 材料与方法

1.1 材料

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、桔霉素(citrinin，CIT)、赭曲霉素A(ochratoxin A，OTA)和牛血清白蛋白(bovine serum albumin、BSA)均为Sigma公司生产，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)为北京索莱宝公司生产，链亲和素为上海源叶生物公司生产；AFB1核酸适配体5′-6-FAM-GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCAC-3′Biotin，结合探针5′-GACAACACGTGCCCAAC-3′-BHQ1参考文献[13]设计，由福州尚亚生物技术有限公司合成；其他试剂均为分析纯；超声波提取仪(KQ-700DE)为昆山超声仪器有限公司生产，SpectraMax M3多功能酶标仪为美国Molecular Devices公司生产。

1.2 检测方法

1.2.1 链亲和素包被浓度的优化 链亲和素用碳酸钠溶液进行稀释，浓度分别为1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL、750 μg/mL和1 000 μg/mL，每孔包被100 μL，4℃包被过夜，用1% BSA进行封闭2 h后用PBST清洗3次，扣干。加入1 000 nmol/L核酸适配体进行反应，25℃振荡孵育30 min，PBST清洗3次，扣干。采用酶标仪检测其荧光值，激发波长为488 nm，吸收波长为518 nm。

1.2.2 核酸适配体浓度的优化 为使标记生物素核酸适配体与包被于板上的链亲和素反应达到平衡，将核酸适配体用Tris-HCl 缓冲液(pH 7.5，NaCl 120 mmol/L、MgCl240 mmol/L 、CaCl220 mmol/L )稀释成浓度分别为1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L、750 nmol/L和1 000 nmol/L，在包被链亲和素的96孔微孔板中分别加入100 μL不同浓度的核酸适配体，25℃振荡孵育30 min，PBST清洗3次，扣干，采用酶标仪检测其荧光强度。

1.2.3 互补序列浓度的优化 将互补序列用Tris-HCl 缓冲液稀释成浓度分别为1 nmol/L、5 nmol/L、10 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、250 nmol/L、500 nmol/L、750 nmol/L和1000 nmol/L，在上述优化的核酸适配体浓度反应后，洗涤，分别加入100 μL不同浓度的互补序列，37℃振荡孵育30 min。用PBST清洗数次，扣干，采用酶标仪检测其荧光强度。

1.2.4 标准曲线的建立 用甲醇溶解AFB1标准品，再用HEPES缓冲液 (pH 7.0，NaCl 120 mmol/L 、KCl 5 mmol/L 、MgCl220 mmol/L 、CaCl220 mmol/L )将AFB1标准品溶液稀释成浓度分别为0、0.001 ng/mL、0.005 ng/mL、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL的标准液。在包被链亲和素的96孔微孔板中加入100 μL上述优化浓度的核酸适配体，25℃振荡孵育30 min，PBST清洗3次，扣干；分别加入100 μL不同浓度的标准品溶液，37℃反应30 min后，用PBST清洗数次，扣干。再加入上述优化的互补序列，37℃反应30 min后，用PBST清洗数次，扣干。最后采用酶标仪检测其荧光强度，根据标准品浓度与荧光值制定标准曲线。

1.2.5 交叉反应性分析 选择AFB1的结构类似物AFB2、AFG1、AFG2及其他霉菌毒素CIT和OTA等作为标准品，溶解稀释成1 ng/mL和10 ng/mL，按上述方法进行检测。

1.2.6 饲料样品检测及加标回收率测定 从市场收集饲料样品数个，准确称取1.0 g样品，加入10 mL甲醇进行提取，涡旋剧烈振荡5 min，超声提取30 min，滤纸过滤，收集滤液1。滤饼再用10 mL甲醇溶解后超声提取，过滤后收集滤液2。合并2次收集的滤液，浓缩至尽干，加入HEPES缓冲液1 mL进行溶解后，采用上述方法检测样品中AFB1含量。选择未检出AFB1的饲料样品进行加标回收率试验，分别向1.0 g饲料样品中添加AFB1标准品(标准品稀释成液体后加入)，使样品中含有1.0 ng/g、5.0 ng/g和10.0 ng/g AFB1，提取后采用建立的方法测定样品的AFB1含量，计算饲料样品的AFB1回收率。

2 结果与分析

2.1 链亲和素包被的优化浓度

从图1看出，随着包被链亲和素浓度的增大，荧光强度也随之增加，当链亲和素浓度达100 μg/mL时，荧光强度达检测最大值，再增大链亲和素浓度其荧光值不再增加，表明此时微孔上包被的链亲和素已达饱和，因此链亲和素浓度选择100 μg/mL。

图1 链亲和素包被浓度的优化

2.2 核酸适配体的优化浓度

从图2看出，随着核酸适配体浓度的增大，荧光强度也随之增加，当核酸适配体浓度达250 nmol/L时，荧光强度达最大值，表明核酸适配体上标记的生物素与包被于板上的链亲和素已达平衡，再增大核酸适配体浓度，其荧光强度的变化不大，因此核酸适配体浓度选择250 nmol/L。

图2 核酸适配体浓度的优化

2.3 互补序列的优化浓度

从图3看出，随着互补序列浓度的增大，荧光值显著降低，原因主要是互补序列与核酸适配体的结合使得其标记的BHQ1基团能有效地淬灭6-FAM基团的荧光，荧光强度随着互补序列浓度的增大而降低，当互补序列浓度达500 nmol/L时，荧光值为1 500 a.u，浓度再增大荧光值变化不大，因此互补序列浓度选择500 nmol/L。

图3 互补序列浓度的优化

2.4 标准曲线

从图4看出，AFB1浓度为0.01～10.0 ng/mL时有较好的线性关系，在此范围内建立标准曲线，其标准方程为y= 4 625.3x+ 11 838(R2= 0.984 9)，最低检测限为0.01 ng/mL。

从表1看出，建立的AFB1检测方法除与AFB2有一定的交叉反应率外，最大交叉反应率为2.8%，与AFG1、AFG2、CIT和OTA的交叉反应率均低于0.7%，表明试验建立的方法具有较好的特异性。

表1 AFB1检测方法与结构相似物的交叉反应率

2.6 样品中AFB1加标回收率

从表2看出，在饲料样品中添加3个浓度AFB1标准品的回收率为91.3%～105.0%，回收率较高，表明建立的检测方法具有较高的准确度，效果较好。

表2 饲料样品中AFB1的加标回收率

3 讨论

近年来，霉菌毒素对人和动植物造成的严重危害，广泛引起政府和大众对动植物食品安全卫生的高度关注。被霉菌毒素污染的饲料，严重影响动物生长和繁殖，同时会随着食物链进入人体，进而造成一系列严重的健康问题。因此，食品质量安全也越来越引起人们的重视，建立快速、灵敏的霉菌毒素检测方法是保障食品安全的重要手段。

核酸适配体指经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段[9]。与基于抗体的酶联免疫法相比，酶联免疫法方法灵敏、快速、操作简单，但会出现假阳性的现象，精确度有待提高[14]；而核酸适配体具有如抗体一样的特性，对可结合的靶分子有严格的识别能力和高度亲和力，建立的基于核酸适配体的检测方法特异性好、灵敏度高。因此，近年来已报道了大量能特异性结合霉菌毒素的核酸适配体，也开发了基于核酸适配体检测AFB1、AFB2和OTA等霉菌毒素的方法和生物传感器[10]。如CASTILLO等[15]开发了一种基于核酸适配体检测AFB1的电化学传感器，检测灵敏度及选择性好，检测限可达(0.40±0.03)nmol。班珺等[16]建立了一种基于AFB1与互补链竞争结合核酸适配体的位点使荧光恢复的转换荧光法检测AFB1的方法，检测浓度范围为1～300 ng/mL，检出限为0.8 ng/mL，对花生、玉米样品的回收率在81.1%～108.3%。金碧瑞等[17]建立了一种基于核酸适配体的上转换荧光纸基传感器测定茶水中AFB1的方法，检测浓度范围为0.1～100 ng/mL，最低检出限为0.03 ng/mL，该方法灵敏度高、特异性强、适用于现场的快速检测。在本研究中，在与AFB1具有高特异性结合的核酸适体末端标记荧光，利用其与AFB1特异性结合后空间构象的改变，与偶联BHQ1的互补序列无法配对，导致荧光值变化而实现检测，构建的方法快速、简便、灵敏度高，可对饲料中的AFB1进行快速检测。

4 结论

建立的基于核酸适配体检测AFB1方法，快速、准确、灵敏度高，在优化条件下，检测浓度范围为0.01～10.0 ng/mL，最低检测限可达0.01 ng/mL，与其他霉菌毒素的交叉反应率低，在饲料样品中加标回收率高，可用于饲料中AFB1的分析检测。