酒糟堆肥固氮微生物的筛选及性能研究

曾祥炼，席晓黎，吴耀领，王和玉，王 莉

(贵州茅台酒股份有限公司技术中心，贵州 仁怀 564500)

0 引言

【研究意义】我国白酒年生产量大约为119.81亿L，而2019年酒糟的排放量已达5 000万t以上[1]。酒糟酸度大，水分含量50%以上，有机质含量高[2-4]，极易腐败，不便存储，若不及时处理，易对环境造成较大的污染，严重威胁酿酒企业的可持续发展。酒糟作为白酒生产的副产物，富含氨基酸、脂质、淀粉、纤维素和木质素等营养成分[5-6]，含有丰富的氮(3.5%)、磷(0.41%)等植物必需元素，重金属含量、蛔虫数、大肠杆菌、抗生素含量极少，是极好的有机肥源[7]。但目前有关接种固氮菌于白酒丢糟中生产高氮含量生物有机肥的研究相对较少，从白酒丢糟中筛选高效固氮能力菌株，对微生物肥料的研发具有现实重要意义。【前人研究进展】微生物肥料是一种无毒环保、环境友好型肥料，是农林业可持续发展的重要研究方向之一[8]。微生物肥料通过特定微生物的生命活动，使作物获得养分供应，具有提高作物产量、影响种植土壤微生物结构、改善生态环境等多种功能[9]。相关研究发现，在高粱种植过程中施加氮肥和磷肥有助于高粱增产及籽粒支链淀粉的积累，而氮、磷、钾肥不足均会造成高粱产量的下降，尤其以缺施氮肥最为显著[10-12]，所以有机肥中氮素含量是其是否适于高粱地施用的重要考察指标之一。【研究切入点】目前已知的固氮细菌主要包括自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌3种类型。其中，共生固氮菌与联合固氮菌因其对共生植物和生长环境要求严格，难以被广泛应用，而自生固氮菌则是制造固氮微生物肥料主要菌种，但由于菌种类型和固氮能力强弱等原因，目前市场上销售的微生物肥料产品质量差异较大[13-14]。因此，筛选高效固氮能力菌株，对研发微生物肥料提供菌种资源显得尤为迫切。【拟解决的关键问题】以白酒丟糟为原料，利用高温好氧堆肥富集优化微生物方式，从堆肥过程的中温、高温阶段原位筛选具有固氮作用的菌株，并对其氨化性能和固氮能力进行研究，为制备高效固氮作用的复合微生物菌剂提供菌种资源和理论依据，以利于白酒丢糟堆肥的顺利进行。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 培养基 改良的阿须贝氏(Ashby)无氮琼脂培养基：葡萄糖(或甘露醇)10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.2 g、K2SO40.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。改良的阿须贝氏(Ashby)无氮液体培养基：葡萄糖(或甘露醇)10 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.2 g、K2SO40.2 g、NaCl 0.2 g、CaCO35 g、蒸馏水1 000 mL。氨化微生物分离培养基(牛肉膏蛋白胨分离培养基)：牛肉膏3～5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、琼脂20～30 g、蒸馏水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121℃蒸汽灭菌30 min。LB培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0～7.4，121℃蒸汽灭菌30 min。YPD培养基：酵母膏5 g、葡萄糖20 g、蛋白胨10 g，pH自然，118℃蒸汽灭菌20 min。

1.1.2 物化材料 鲜酒糟：含水量56.8%、全P 2.34 mg/g、全N 24 mg/g、有机质80.9%、 pH 3.6。风干酒糟：调节水分至50%～60%。新鲜稻草：粗纤维35.5%～45%、木质素21%～26%。以上材料均由贵州茅台酒股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 氨化微生物的筛选

1) 氨化微生物的初次富集。将风干酒糟与新丢酒糟混合配制材料，风干酒糟占新丢糟重量的10%左右，利用风干酒糟调节堆糟水分含量为50%～60%。具体操作：堆体底部直径2 m左右，堆体呈圆锥形，底铺1层风干酒糟(厚约5 cm)，上铺1层鲜酒糟(15～20 cm)，如此反复，至堆体高1.2 m左右完成堆砌。每3 d人工翻堆1次。堆肥48 h(堆体温度55℃)完成微生物初次富集。

2) 氨化微生物的第2次富集。以初次富集的堆体酒糟作接种材料，新丢酒糟与初次富集的堆体酒糟按2︰1比例混合，并按混合后总重量的1%添加碎稻草，继续富集并优化微生物，接种后4 d左右完成第2次富集。

3) 中温微生物样品采集。待第2次富集堆体平均温度上升至60℃以上时，去掉堆体表层的结壳，在距离表面20 cm处(温度约45℃)按东南西北4个方位分别取堆肥样品，混合后进行中温型微生物的分离和纯化。

4) 高温微生物样品采集。待第2次富集堆体平均温度上升至60℃以上，并持续6 d以上后，去掉堆体表层的结壳，在距离表面30 cm处(温度>61℃)按东南西北4个方位分别取堆肥样品，混合后进行高温型微生物的分离和纯化。

5) 氨化微生物的初步检测。将分离纯化后的微生物制备成菌悬液，用纳氏试剂显色法进行初步检测，若出现红棕色或黄色沉淀证明培养液中有氨化微生物。

1.2.2 微生物氨化能力测定 将上述筛选出的具有显色反应的微生物菌株活化后，按4%体积比的菌液量接种到200 mL LB液体培养基或YPD液体培养基中，每株菌3个重复。然后置于恒温摇床上120 r/min震荡培养，分别在0 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h用纳氏试剂参照《水质铵的测定-纳氏试剂比色法》(GB 7479-87)测定液体中氨态氮含量。并用SPSS对菌株氨态氮的生成率进行分析。

1.2.3 固氮作用考察 将初步筛选得到的菌株分别按5%的接种量(OD600约为1.0)接种于装有100 mL改良的阿须贝氏无氮液体培养基的250 mL锥形瓶中，置于28℃、120 r/min培养3 d。以上每个步骤均设3个重复和1个空白对照，凯式定氮法测定固氮效能[15]。

1.2.4 菌株鉴定 将具有氨化作用和固氮性能的菌株保藏，并送中国科学院微生物研究所进行16S rRNA序列和ITS序列菌株鉴定及生理生化试验。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS数据处理软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 筛选氨化微生物

2.1.1 微生物初步富集 堆肥24 h后温度快速升高，48 h后达55℃以上并进入堆肥高温期。堆肥初期微生物含量为：霉菌1×102CFU/g，细菌1×105CFU/g。至堆肥48 h时，完成微生物的初步富集，霉菌含量达1.2×106CFU/g，细菌含量达4.5×107CFU/g。初步堆肥后，微生物含量大幅增加，满足作为第2次富集接种材料的要求。

2.1.2 中、高温型堆肥酒糟微生物菌株 通过第2次富集试验，完成对中、高温型堆肥酒糟微生物的分离纯化，初步获得14株不同菌落形态的菌株。其中，中温细菌有MX1、MX8、MX13、MX3和MJ1共5株，中温霉菌有MM2、MM1和MM6共3株；高温细菌有TX1、TX2和TX3共3株，高温霉菌有TM2、TM1和TM3共3株。14株不同菌落形态的菌株在阿须贝培养基中生长良好。

2.1.3 具有氨化性能的菌株 根据菌株在阿须贝固态培养基上生长的菌落种类，通过微生物计数，选择具有数量优势的9株进行纳氏显色试验，分别为4株中温细菌MX1、MJ1、MX6和MX8，2株中温霉菌MM2和MM6，1株中温酵母MJ4，1株高温霉菌TM1，1株高温细菌TX1。根据纳氏显色试验显色圈直径大小筛选出具有氨化性能的菌株5株，分别为MM6、MX8、MX1、TX1和MJ。从图1看出，MM6、MX8、MX1、TX1和MJ菌株菌纳氏试剂显色后的显色圈较大，可初步定性为具有氨化作用的菌株。

图1 菌株的纳氏试剂显色圈直径

2.2 菌株的氨化能力

从图2可知，培养0～48 h，MM6、MX1和MX8株菌的氨态氮增长速率明显高于TX1和MJ。培养48 h时，菌株MX8、MM6、MX1的氨态氮生成率分别为2.0 mg/h、1.7 mg/h和1.1 mg/h，且与TX1、MJ菌株在48 h时的生成率存在显著性差异(P<0.05)，培养48～72 h 期间，MM6、MX1和MX8氨态氮生成率逐渐下降，TX1和MJ菌株氨态氮生成率缓慢增加；培养120 h，5株菌氨态氮的生成速率均接近0。表明，培养过程中菌株MM6、MX1和MX8具有较强的氨化作用。

图2 菌株液态培养氨态氮的生成率

2.3 菌株的固氮性能

从图3看出，对分离得到的5株菌在无氮液态培养基中培养3 d后，MX8菌株总氮含量为22.0 mg/L、MX1为15.8 mg/L，MX8、MX1菌株的固氮能力高于TX1、MM6和MJ菌株， MX8和MX1具备作为生产固氮微生物菌剂的潜力。

图3 株菌在无氮液态培养基中培养3 d的总氮含量

2.4 菌株鉴定

对5株菌进行16SrRNA和gyrB基因序列鉴定，结果表明， MX8和TX1菌株同属于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，MX1为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，MJ为皱落假丝酵母(Candidarugosa)，MM6为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。

根据理化试验，MX8、MX1和TX1 3株细菌均为革兰氏阳性菌，能产淀粉酶水解淀粉，产蛋白酶水解酪素，能够还原硝酸盐，可利用纤维二糖帮助纤维素降解；TX1和MX1菌株还能产果胶酶水解果胶；MX8和TX1不耐酸，pH 5.0下不能生长，属于兼性厌氧菌；MX1菌株pH 5.0下能生长，属好氧菌。MJ为皱落假丝酵母，可利用麦芽糖和可溶性淀粉，能同化纤维二糖，该菌不仅能在25℃下迅速生长，在37℃也能生长，用于固体酒糟堆肥能促进堆肥有机物降解，加快堆肥升温；而MM6在生理生化特性方面不具备作为堆肥菌剂的潜能。

3 讨论

氨化微生物能把培养基中的有机氮源经氧化、还原、转化等步骤逐渐转化为氨态氮。研究采用纳氏试剂显色法和阿须贝氏(Ashby)无氮培养法从白酒丢糟堆肥中筛选出5株具有氨化能力和固氮作用的菌株，分别为细菌MX8、TX1和MX1，酵母菌MJ，霉菌MM6。5株菌氨化试验结果发现，培养48 h时，菌株MX8、MM6、MX1的氨态氮生成率分别为2.0 mg/h、1.7 mg/h和1.1 mg/h，具有较强的氨化作用。5株菌在无氮液态培养基中培养3 d后，菌株MX8、MX1总氮含量分别达22.0 mg/L、15.8 mg/L，固氮能力强。通过分子生物学鉴定及生理生化试验表明，菌株MX8和TX1菌株同属于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，MX1为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，MJ为皱落假丝酵母(Candidarugosa)，MM6为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)。生理生化试验显示，MX8、MX1和TX1株菌有一定的蛋白质、淀粉、纤维素、果胶等有机质的水解能力，MJ能同化纤维二糖，在固体酒糟堆肥过程中能促进有机质的降解，缩短腐熟进程，加快堆肥升温。结合固氮能力的考察结果，确定MX8和MX1具备作为生产固氮微生物菌剂的潜能，但因试验条件限制，还未对MX8和MX1进行大规模的固氮生产试验，因此距投入实际生产应用还有一定距离。

4 结论

从白酒丢糟堆肥中筛选得到2株芽孢杆菌MX8和MX1，具有较高的固氮性能，具备作为生产固氮微生物丢糟肥料菌种的潜力。若通过一定规模生产试验验证其固氮性能，则可作为制备高效固氮作用的复合微生物菌剂的菌种资源应用于白酒丢糟堆肥，以加强白酒丢糟的有效利用，且缓解白酒丢糟造成的环境污染。