基于生物信息学研究CXCL13在非小细胞肺癌中的作用

陈富刚 马南 何志义

广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科,南宁 530021

85%左右的肺癌患者病理类型为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1],NSCLC主要分为肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)和肺鳞癌(lung squamous carcinoma,LUSC)[2]。随着近几年来靶向治疗及免疫治疗在NSCLC中的开展,对部分患者的疾病缓解起到了显著延长的作用,但是寻求更有效的治疗方法以及如何解决免疫细胞肿瘤内浸润仍然是目前研究的一个重点。

CXC类趋化因子及其受体已被发现在血管生成,肿瘤细胞的侵袭,转移和迁移过程中有着非常的重要作用[3]。CXCL13又称为B淋巴细胞趋化因子,与炎症、免疫密切相关,CXCL13最初被称为B淋巴细胞趋化因子(B lymphocyte chemoattractant,BLC)或BCA-1,是一种稳态趋化因子。它由次级淋巴组织(滤泡)B细胞区的基质细胞组成性分泌,如脾脏、淋巴结、扁桃体[4-5]。CXCL13主要分布在胃、肝脏和淋巴结中,在调控肿瘤生长,并参与肿瘤进展和转移[6]。

免疫细胞浸润现在已成为研究肿瘤的热点,对它的类别和功能的研究将会加深对肿瘤的发生发展的了解。肿瘤微环境中的免疫状态在肿瘤的发生、发展中有着重要价值,在判断预后方面也具有指导意义,对肿瘤相关组织的结构、功能和代谢产生影响,肿瘤细胞内环境也会对其产生影响效果[7]。除了肿瘤细胞外,肿瘤微环境还包括众多免疫细胞,如B细胞、自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TILs)、肿瘤相关巨噬细胞(tumorassociated macrophages,TAMs)等[8]。

单细胞测序技术作为一种新兴的测序技术得到了快速成长,并且已经成为了一项成熟技术,已在表观遗传、基因、蛋白质、转录等多个组学水平完成测序,可在单个细胞的不同组学水平上对恶性肿瘤异质性、肿瘤演变以及临床诊治等多个方面进行深入地研究[9]。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成内容,在肿瘤细胞中DNA整体呈低甲基化状态而某些特定区域如启动子区高甲基化状态[10-11]。DNA甲基化因为它的稳定性和容易检测,已经被证实有显著的临床实用价值[12]。

Wang等[13]的研究证实了CXCL13在NSCLC患者血清中、肺组织中升高,提示CXCL13参与NSCLC疾病进展,但是CXCL13在NSCLC中与免疫浸润、癌细胞功能等机制的研究目前较少。本研究拟联合使用免疫细胞浸润、单细胞测序及甲基化相关数据库,研究CXCL13在NSCLC中的作用,特别是CXCL13与NSCLC中免疫细胞浸润的关系,为进一步深入研究CXCL13在NSCLC中的作用提供帮助。

1 资料与方法

1.1 差异基因查找 使用Gepia数据库查找NSCLC正常组织与癌组织差异基因,分析数据来源于2020年7月1日 前Gepia数 据 库 收 录 的TCGA数据,在高表达差异基因中筛选出与炎症相关的CXCL13。分析方法选用LIMMA算法。LUAD组中,癌症483例,对照347例。LUSC组中,癌症486例,对照338例。筛选标准:log2FC＞1且P＜0.05为差异有统计学意义。

1.2 验证CXCL13蛋白在NSCLC患者中的表达 使用Proteinatlas数据库中免疫组织化学结果,分析CXCL13在NSCLC患者癌组织以及正常肺组织中蛋白表达情况。

1.3 CXCL13与NSCLC肿瘤功能相关性 使用CancerSEA网站分析CXCL13在不同NSCLC单细胞数据集中与癌症各种功能状态之间的相关性,使用Spearman相关系数分析。

1.4 CXCL13在NSCLC中甲基化情况 使用Ualcan数据库分析CXCL13在NSCLC中甲基化水平,以及CXCL13甲基化水平与NSCLC患者吸烟、分期、TP53突变、临床分期、淋巴结受累之间的关系。

1.5 CXCL13与NSCLC中免疫细胞浸润关系使用TIMER数据库中使用反卷积算法得到的LUSC和LUAD中免疫细胞浸润组成,分析CXCL13表达与NSCLC中B细胞、T细胞CD8+细胞、Tregs细胞免疫浸润的相关性,并同时使用多因素分析研究CXCL13表达、B细胞、T细胞CD8+细胞、Tregs细胞免疫浸润与NSCLC预后的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CXCL13在NSCLC中m RNA表 达CXCL13在NSCLC中m RNA的表达在癌组织中明显高于正常组织(P＜0.05),见图1。

图1 CXCL13在NSCLC中mRNA表达情况(a P＜0.05)

2.2 CXCL13在NSCLC肺组织中蛋白表达情况Proteinatlas数据库验证CXCL13在NSCLC肺组织中蛋白表达情况。CXCL13在NSCLC肺组织中表达稍高于正常肺组织,见图2。

图2 CXCL13在NSCLC肺组织中蛋白表达情况 A、D:正常肺组织；B、C:LUAD；E、F:LUSC

2.3 CXCL13与NSCLC肿 瘤 功 能 相 关 性CancerSEA分析CXCL13在不同NSCLC单细胞数据集中各种功能状态活动之间的相关性(图3)。

图3 CXCL13与NSCLC肿瘤功能相关性 A:Kim(EXP0068)提示CXCL13与细胞周期、侵袭、DNA损伤和修复等相关。B:详细功能关联提示CXCL13表达在NSCLC患者中与转移和侵袭呈正相关(Spearman系数分别为0.34、0.31,P＜0.001),与DNA修复呈负相关(Spearman系数为-0.34,P＜0.001)

2.4 CXCL13在NSCLC中甲基化情况 Ualcan分析CXCL13在NSCLC中甲基化水平,在LUSC患者癌组织、吸烟者组织以及无论是否存在P53突变、患者处于不同的临床分期、不同淋巴结受累程度的情况下,多观察到CXCL13甲基化水平降低(图4),而在LUAD患者中结果多为相反(P＜0.05)(图5)。

图4 不同LUSC患者中CXCL13甲基化水平 A:肿瘤早期；B:肿瘤不同时期；C肿瘤转移；D:P53突变；E:吸烟情况

图5 不同LUAD患者中CXCL13甲基化水平 A:肿瘤早期；B:肿瘤不同时期；C肿瘤转移；D:P53突变；E:吸烟情况

2.5 CXCL13表达在NSCLC中免疫细胞浸润关系 利用TIMER网站分析CXCL13在NSCLC中免疫浸润水平。CXCL13的表达在NSCLC患者中肿瘤纯度呈负相关,与NSCLC患者B细胞、T细胞CD8+细胞、Tregs细胞浸润呈正相关(P＜0.05),但相关程度比较低(Rho＜0.7,图6～9)。经多因素Cox回归分析,CXCL13高表达合并高水平T细胞CD8+细胞浸润组LUSC患者预后好于CXCL13高表达合并低水平T细胞CD8+细胞浸润组(P＜0.05),CXCL13高表达合并低水平Tregs细胞浸润组LUSC患者预后好于CXCL13高表达合并高水平Tregs细胞浸润组(P＜0.05)。其余分组预后差异均无统计学意义(图10)。

图6 LUSC患者T细胞CD8+细胞、Tregs细胞、B细胞浸润程度与预后关系

图7 LUAD患者T细胞CD8+细胞、Tregs细胞、B细胞浸润程度与预后关系

图8 LUSC患者T细胞CD8+细胞、Tregs细胞、B细胞浸润程度与预后关系

图9 LUAD患者T细胞CD8+细胞、Tregs细胞、B细胞浸润程度与预后关系

图10 CXCL13的表达与NSCLC患者Tregs细胞免疫浸润水平与预后的关系,使用QUANTISEQ算法分析 A:肺腺癌；B:肺鳞癌

3 讨论

炎症是机体对刺激的一种防御反应,也是肿瘤的标志之一,在肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用,而趋化因子是肿瘤中炎症细胞浸润的最重要的介质分子[14]。趋化因子不仅可诱发炎症细胞浸润肿瘤细胞,而且还可促进新生肿瘤细胞存活、侵犯及增殖[15]。

CXCL13是一种炎症趋化因子,本研究通过Gepia筛选NSCLC中存在差异表达的基因,CXCL13m RNA在NSCLC癌组织中表达明显高于正常组织,进一步使用Proteinatlas数据库验证CXCL13在NSCLC肺组织中蛋白表达情况,结果显示在CXCL13蛋白表达在NSCLC肺组织中高于正常肺组织。

T滤泡辅助细胞(TFH cell)的浸润并产生的CXCL13对肿瘤部位产生B细胞反应非常重要,并与促进局部记忆B细胞分化以及T调节细胞亚群的扩张有关[16]。在B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)细胞的微环境调节中CXCL13/CXCR5轴具有特别重要的作用,B-CLL即外周血、次级淋巴组织和骨髓中CD5+肿瘤性B细胞的单克隆群体,次级淋巴器官和骨髓是B-CLL细胞增殖的庇护所,也保护它们免受自发或药物诱导的凋亡。CXCL13/CXCR5信号有助于B-CLL细胞进入这些庇护所[17]。本研究结果显示CXCL13与NSCLC中B细胞浸润存在明显相关性,且B细胞浸润与不良预后明显相关。CD8+T细胞密度被认为是一个强效的生存预测指标,CD8+T细胞密度也被认为与免疫治疗的疗效密切相关[18]。在癌症晚期、化疗后的患者中均显示CD8+T细胞密度与预后密切相关[19-20],而肿瘤微环境中CD8+T细胞的浸润程度增高与良好预后相关。Tregs和Treg释放的免疫抑制因子进入肿瘤的微环境是重建抗肿瘤免疫反应的一种途径[21]。NSCLC患者肿瘤组织、骨髓、淋巴结或外周血中高密度的异源性Treg被认为是肿瘤预后的预测因子[22]。本研究结果显示CXCL13在NSCLC中CD8+T细胞和Treg细胞呈正相关(P＜0.05),但与Treg细胞相关系数较低。提示CXCL13的表达增高与NSCLC中CD8+T浸润密切相关,与Treg细胞浸润亦存在相关性,但仍需要进一步深入研究。

CancerSEA是分析单细胞测序的数据库,使用该数据库分析CXCL13在NSCLC各种细胞群及其功能的相关性,结果提示CXCL13表达在NSCLC细胞癌转移、血管生呈正相关,与DNA修复呈负相关。之前的研究已经显示CXCL13在肺癌组织明显高表达,诱导肿瘤细胞迁移[13,23]。在NSCLC患者中CXCL13/CXCL5参与肿瘤淋巴结转移,体外实验显示CXCL 13刺激可以显著促进NSCLC来 源 的NCI-H1915细 胞 迁 移[23]。CXCL13在肺癌小鼠模型中通过促进巨噬细胞释放SPP1,从而促进癌细胞迁移[13]。CXCR1、CXCR2和CXCR4及其配体CXCL5、CXCL8和CXCL12的高表达似乎与肿瘤血管生成有关[23],但是,CXCL13与肿瘤中血管生成、DNA修复的具体机制目前仍缺乏具体研究。

DNA甲基化与肿瘤的发生发展风险有关,有可能在癌症早期就发生[24],DNA甲基化状态的改变也被作为癌症初期诊断和治疗的标记物与药物靶点之一。癌症细胞中DNA序列改变可伴随启动子区域呈现出高甲基化状态,但全基因组的状态处于低甲基化[10-11]。高甲基化状态主要通过抑制正常基因的表达进而诱发癌症[25]。而低甲基化状态一般表现在重复序列上,降低染色体的稳定性,也会启动部分原癌基因来加快肿瘤发生[26-27]。CXCL13在LUSC中的启动子甲基化与正常组织相比多处于低甲基化状态,无论从分期、是否有TP53基因突变或者是否吸烟,而在LUAD中则多处于高甲基化状态,趋化因子和受体上调是由不同的机制驱动的,包括CXCL13基因的Rel A和Nrf2的转录控制,以及CXCR5启动子的表观遗传调控(缺乏Cp G岛甲基化)[28]。CXCL13在LUSC、LUAD中的甲基化水平不同,具体机制及临床应用需要待进一步深入研究。

本研究基于生物信息学,通过使用TIMER、CancerSEA、Gepia等数据库来进行分析研究CXCL13在NSCLC中的功能。但是,本研究仍有一些不足之处,首先很多趋化因子与肿瘤免疫浸润有着联系,比如CXCL8、CXCL12、CXCL21等,但是我们未能全面而系统地研究趋化因子家族在NSCLC中的功能,其次肿瘤免疫浸润参与的细胞包括有很多种,如CD4+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等,本研究只分析了其中三种。

总之,通过生物信息学方法,我们分析了CXCL13在NSCLC中的作用,CXCL13的高表达与NSCLC中B细胞、CD8+T细胞和Tregs细胞的免疫浸润相关,但与Tregs细胞的免疫浸润相关性较低。CXCL13与NSCLC的转移与侵袭有关,并且通过启动子甲基化的参与肿瘤的发生发展,其在LUSC和LUAD的 作 用 不 同。CXCL13参 与NSCLC的免疫细胞浸润及肿瘤细胞功能,因此通过靶向免疫抑制CXCL13,也许可以作为今后对NSCLC的免疫治疗方法之一。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突