凤冈绿茶中有效成分的提取工艺

卢利平 丁功涛 刘苗 张利 杨舜铨 高丹丹 臧荣鑫

摘要：以鳳冈绿茶为原料，探讨并确定没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG提取的最佳工艺条件。在甲醇浓度、浸提温度、浸提时间、料液比4个单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验设计和高效液相色谱法（HPLC）检测，以没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量为指标确定最佳工艺参数。结果表明，各有效成分的最佳提取工艺条件为：甲醇浓度70%，浸提温度65 ℃，浸提时间40 min，料液比为1 ∶ 30（g/mL）;此工艺条件下得到凤冈绿茶浸提液中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量分别为（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g，精密度、重复性和回收率的RSD均小于5%。该结果可为凤冈绿茶的进一步研究提供理论基础，也为开拓其茶保健产品提供参考依据。

关键词：凤冈绿茶;提取工艺;正交试验;HPLC;没食子酸;咖啡因;可可碱;EGC;EGCG

中图分类号： TS272.2;TS201.1  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）13-0170-06

多酚类物质是茶叶中主要的功效成分，包括儿茶素、黄酮醇及其配合物、无色花青素、酚酸及缩酚酸等[1]，儿茶素类物质占茶多酚总量的60%～80%，主要包括儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素（EGC）、表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）等单体物质，具有抗氧化、抗突变、抗癌[2]、抗衰老、降血脂、抑菌和抑制病毒等功效[3-4]。没食子酸是茶叶中一种重要的酚酸类物质，可能与某些茶类的保健功效有密切关系[5]。生物碱主要包括咖啡因、可可碱和茶碱[6]，这些成分是茶汤重要的滋味物质[7-9]，在茶叶的保健功效和分类品鉴上起到重要作用[10]。茶叶中的有效成分是评价和控制茶叶质量的标准，可以快速鉴定茶叶品质[11]。综合国内外对没食子酸、咖啡因、可可碱、儿茶素等的检测方法分析得出[12-14]，高效液相色谱法因其应用广泛、灵敏度高、精确度好且技术成熟等成为主要的检测方法[15-18]。

武陵山片区生态条件优越，是优质茶叶的历史产区，而且多以春茶采摘为主[19]。贵州省遵义市凤冈县茶叶生产已成为当地山区茶农的主要收入来源[20-21]，但茶资源利用率不高，有关凤冈绿茶有效成分的提取技术文献鲜有报道[22]。本研究通过对凤冈绿茶中的提取工艺条件进行优化，利用高效液相色谱（HPLC）同时测定没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量，为进一步研究凤冈绿茶的保健功效提供理论依据，同时为武陵山片区凤冈绿茶深加工产品的生产及产品质量控制提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG均为分析纯，购自成都德思特生物技术有限公司;甲醇、乙腈、乙酸均为色谱纯，购自奥科生物技术有限公司;凤冈绿茶，购自贵州省凤冈县娄山春茶叶专业合作社;娃哈哈水，购自杭州娃哈哈集团有限公司。

1.2 主要仪器与设备

Agilent Technologies 1200 高效液相色谱仪（DAD 检测器）、Lichrospher C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），购自美国Agilent公司;HWS28型LCQ电热恒温水浴锅、BWS-0505型恒温水槽水浴锅，购自上海一恒科学仪器有限公司;Dor Yang DA型电子分析天平，购自渡扬精密仪器（上海）有限公司;WJX-200型高速多功能粉碎机，购自上海缘沃工贸有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 茶粉的预处理 将茶叶在粉碎机中粉碎后过 40目筛，称取一定质量的茶粉于50 mL离心管中，加入预热过的浸提溶剂5 mL，立即转入水浴中浸提一定时间，冷却至室温，在12 000 r/min转速下离心10 min后收集上清液，重复浸提1次，合并所得上清液。准确取上清液2 mL于5 mL容量瓶中，稀释并定容至刻度，过0.22 μm膜，即为待测液。

1.3.2 高效液相色谱条件选择[22-23] 利用高效液相色谱仪对待测液进行检测，流动相A：90 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（10 g/L），去离子水定容至1 L;流动相 B：800 mL乙腈、20 mL乙酸、2 mL EDTA溶液（10 g/L），以去离子水定容至1 L，流动相A、B液需过0.22 μm膜。综合考虑测定波长为278 nm、柱温35 ℃、流速为1.0 mL/min，进液量为10 μL。待流速和柱温稳定，基线跑平后，序列运行并作空白对照，测试液以峰面积定量。梯度洗脱条件[24]见表1。

1.3.3 标准溶液的配制 将25 mL EDTA溶液（10 g/L）、25 mL抗坏血酸溶液（10 g/L）、50 mL乙腈以去离子水定容至500 mL，制得稳定溶液。准确称取没食子酸标准品0.02 g，以稳定溶液溶解于 10 mL 容量瓶并定容至刻度，没食子酸标准储备液浓度为2 mg/mL;分别移取没食子酸储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于6个10 mL容量瓶中，用稳定溶液溶解并定容至刻度，没食子酸标准品溶液浓度分别为0、40、80、120、160、200 μg/mL。咖啡因、可可碱、EGC、EGCG标准品溶液配法同上。

1.3.4 提取工艺条件的单因素试验 （1）甲醇浓度对提取工艺的影响。在料液比为1 g ∶ 25 mL，浸提温度为70 ℃，浸提时间为30 min，甲醇浓度（甲醇水溶液）分别为0、65%、70%、75%、80%、85%的条件下，利用HPLC检测没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量。（2）浸提温度对提取工艺的影响。在料液比为1 g ∶ 25 mL，浸提时间为 30 min，甲醇浓度为70%，浸提温度分别为55、60、65、70、75 ℃ 的条件下，利用HPLC检测没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量。（3）浸提时间对提取工艺的影响。在料液比为1 g ∶ 25 mL，甲醇浓度为70%，浸提温度为70 ℃，浸提时间分别为10、20、30、40、50 min的条件下，利用HPLC检测没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量。（4）料液比对提取工艺的影响。在甲醇浓度为70%，浸提温度为70 ℃，浸提时间为40 min，料液比分别为1 ∶ 15、1 ∶ 20、1 ∶ 25、1 ∶ 30、1 ∶ 35（g ∶ mL）的条件下，利用HPLC检测没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量。

1.3.5 正交试验设计 通过单因素试验结果分析确定正交试验条件范围，选取甲醇浓度、浸提温度、浸提时间、料液比作为工艺优化的响应值，工艺优化试验选取甲醇浓度、浸提温度、浸提时间、料液比4个因素进行L9（34）水平正交试验，分析各因素对没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG浸出量的影响，以期获得没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG浸出量均高的组合，正交试验设计见表2。

1.3.6 方法学考察 取1份待测茶样，按上述提取工艺优化条件操作，HPLC连续测定5次，评价方法的精密度;取同一批6份凤冈绿茶茶粉，按照上述提取工艺优化条件处理，进行重复性考察，评价方法的稳定性;在已知各组分浓度的茶粉中加入不同浓度相对应的标准品，评价方法的回收率。精密度、重复性及回收率均用相对标准偏差（RSD）来衡量。

RSD=s/x×100%。

式中：s表示标准偏差;x表示平均值。

1.4 数据分析

数据处理采用Excel 2016软件，制图采用Oiginpro 8.0软件。每组试验重复3次，结果以平均值作为最终的测量值（SPSS 16.0分析数据之间的显著性差异）。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

在既定的高效液相色谱条件下，各标准溶液，没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG相应的峰面积值（y）与浓度（x）的线性回归方程及相关系数见表3。可知，没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浓度与对应峰面积呈良好的线性关系，其相关系数均在0. 999以上。

2.2 单因素试验

2.2.1 甲醇浓度对提取工艺的影响 由图1可知，随着甲醇浓度的增加，没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量曲线先缓慢上升后趋于平缓，其中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC的增长趋势相对于EGCG较为平缓。当甲醇浓度为0，即选择纯水做浸提溶剂时，虽然能检测到各组分的浸出量，但是检测量都比较低;当甲醇浓度为70%时，EGC、EGCG含量达到最大值，这与国标法GB/T 8318—2008《食品添加剂 生姜（精）油（蒸馏）》里提取剂为70%甲醇的条件[24]相一致。继续增加甲醇浓度，各组分的浸出量略有下降，EGC的下降程度明显高于其他物质，可见甲醇浓度对EGC的影响较大。经过综合考虑单因素结果，选择甲醇浓度为70%、75%、80%做正交试验设计。

2.2.2 浸提温度对提取工艺的影响 由图2可知，在一定温度范围内，没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量随着浸提温度的升高不断增加，咖啡因、EGC、EGCG的增长趋势较为明显;当浸提温度达到70 ℃时，EGCG浸出量达到最大值，为130.95 mg/g即约占13.10%;在同样温度下浸提道泉雅女茶EGCG含量最大为6.04%[25]，可见凤冈绿茶中EGCG的含量相对较高;继续升高温度各组分含量增长较为平缓且咖啡因、EGC、EGCG略微有下降趋势。究其原因，茶叶提取工艺过程其实是各组分向浸提溶剂扩散的过程，随着温度的升高，扩散速度逐渐提高，但当温度高于某个特定值后，EGC、EGCG易发生氧化作用，测定值略有降低，继续升高温度对浸出量的影响不大。经过综合考虑单因素结果，选择浸提温度65、70、75 ℃做正交试验设计。

2.2.3 浸提时间对提取工艺的影响 由图3可知，当浸提时间为10 min时，各组分浸出量都较低;浸提时间超过30 min后，可可碱和没食子酸浸出量增加缓慢;当浸提时间达到40 min时，咖啡因、EGC、EGCG浸出量达到最大值，而后EGC、EGCG浸出量均有明显的下降趋势，可能随着浸提时间延长，EGC、EGCG部分发生氧化作用，测定值降低。经过综合考虑单因素结果，选择浸提时间30、40、50 min做正交试验设计。

2.2.4 料液比对提取工艺的影响 由图4可知，随着浸提溶剂的增加，没食子酸、咖啡因、可可堿、EGC、EGCG的浸出量先缓慢增加后趋于稳定;当料液比达到1 g ∶ 25 mL时，咖啡因、EGC、EGCG浸出量达到最大值;继续添加浸提溶剂，各组分浸出量变化不大。究其原因，茶粉中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的含量是一定的，当料液比到达一定值后，各组分浸出量已达到最大值，继续添加浸提溶剂，部分EGC与EGCG由于高温发生氧化作用而使测定值偏低[20]。经过综合考虑单因素结果，选择料液比1 g ∶ 25 mL、1 g ∶ 30 mL、1 g ∶ 35 mL做正交试验设计。

2.3 正交试验设计

在L9（34）水平正交试验设计中进行4因素3水平试验，正交试验结果见表4。可以看出，影响凤冈绿茶中没食子酸浸出量的因素主次顺序为B>D>C>A，即浸提温度>料液比>浸提时间>甲醇浓度;最佳浸提组合为A2B3C3D1，即甲醇浓度75%，浸提温度75 ℃，浸提时间50 min，料液比 1 g ∶ 25 mL。影响咖啡因浸出量的因素主次顺序为D>A>C>B，即料液比>甲醇浓度>浸提时间>浸提温度;最佳浸提组合为A1B2C2D1，即甲醇浓度70%，浸提温度70 ℃，浸提时间40 min，料液比 1 g ∶ 25 mL。影响可可碱浸出量的因素主次顺序为A>B>C>D，即甲醇浓度>浸提温度>浸提时间>料液比;最佳浸提组合为A1B1C3D2，即甲醇浓度70%，浸提温度65 ℃，浸提时间50 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。影响EGC浸出量的因素主次顺序为A>B>C>D，即甲醇浓度>浸提温度>浸提时间>料液比;最佳浸提组合为A1B1C2D2，即甲醇浓度70%，浸提温度65 ℃，浸提时间40 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。影响EGCG浸出量的因素主次顺序为C>B>A>D，即浸提时间>浸提温度>甲醇浓度>料液比;最佳浸提组合为A1B1C2D2，即甲醇浓度70%，浸提温度65 ℃，浸提时间40 min，料液比 1 g ∶ 30 mL。

将甲醇浓度70%增大到75%，没食子酸浸出量增加了0.07 mg/g，可见其影响并不明显，故选取甲醇浓度为70%;在65、70、75 ℃的浸提温度梯度内，综合考虑各组分浸出量变化结果，选取浸提温度为65 ℃;浸提时间从40 min延长至50 min，没食子酸和可可碱在浸提溶剂中的含量分别相对持平，故选取浸提时间为40 min;单独考虑1 g ∶ 25 mL到 1 g ∶ 35 mL料液比的变化，没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量变化很小，且可可碱、EGC、EGCG在料液比为1 g ∶ 30 mL时取得较高浸出量，故最终考虑选取料液比为1 g ∶ 30 mL。综合考虑选择浸提的最佳工艺组合为A1B1C2D2，即甲醇浓度70%，浸提温度65 ℃，浸提时间 40 min，料液比1 g ∶ 30 mL。

2.4 样品验证试验

对确定的最优浸提条件，即甲醇浓度为70%、浸提温度为65 ℃、浸提时间为40 min、料液比为 1 g ∶ 30 mL，进行验证试验，测得没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量分别为（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g。在优化工艺条件下，凤冈绿茶中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的综合提取率相对较高。张俊英等的研究表明浸提凤冈锌硒茶时甲醇浓度优化结果为70%，这与本研究部分结果[22]相吻合。

2.5 方法学考察

由表5可以看出，对于精密度考察，HPLC检测凤冈绿茶中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的相對标准偏差（RSD）分别为0.5%、0.4%、0.8%、0.4%、0.5%，符合国标GB 5009.12—2017中规定的精密度要求[26]。对于重复性的考察，没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的相对标准偏差分别为0.6%、1.3%、1.6%、1.6%、1.2%，表明此方法有较好的重复性。对于回收率的考察，没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的相对标准偏差分别为0.6%、1.5%、1.8%、2.3%、2.3%，表明此方法有较高的准确性。精密度、重复性和回收率的RSD均小于5%，表明仪器精密度良好，方法重复性好，结果准确性高[22]。

3 结论

本研究在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验设计对凤冈绿茶中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的提取工艺条件进行了优化，确定凤冈绿茶中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的最佳浸提工艺参数：甲醇浓度为70%、浸提温度为65 ℃、浸提时间为40 min、料液比为1 g ∶ 30 mL。在此优化工艺条件下，HPLC测得没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG的浸出量分别为（1.58±0.06）、（48.62±1.03）、（20.31±0.56）、（44.36±0.67）、（136.28±1.32） mg/g。该结果表明，通过对其提取工艺条件进行优化，相比较凤冈锌硒茶[22]，凤冈绿茶中没食子酸、咖啡因、可可碱、EGC、EGCG溶出更彻底。精密度、重复性和回收率的RSD均小于5%，表示该方法测定效果良好，结果准确有效，可为更全面地反映凤冈绿茶品质提供一定的数据基础，同时为进一步研究相关茶保健品提供理论依据，对提高凤冈绿茶的利用率具有重要意义。

参考文献：

[1]赵 磊，高 民，马燕芬. 茶多酚的抗氧化作用及其机制[J]. 动物营养学报，2017，29（6）：1861-1865.

[2]Yang C S，Li G X，Yang Z H，et al. Cancer prevention bytocopherols and tea polyphenol[J]. Cancer Letters，2013，334（1）：79-85.

[3]王 琳. 茶叶中有效生化成分高效液相色谱检测法的建立及其在凤凰乌龙茶检测中的应用[D]. 南京：南京农业大学，2010.

[4]Singh B N，Shankar S，Srivastava R K. Green tea catechin，epigallocatechin-3-gallate （EGCG）：mechanisms，perspectives and clinical applications[J]. Biochemical Pharmacology，2011，82（12）：1807-1821.

[5]郭俊凌，李成亮，郑怡萌，等. 茶叶中没食子酸含量测定的离子化萃取分离分光光度法研究[J]. 食品科学，2010，31（4）：150-155.

[6]马存强，周斌星，王洪振，等. 普洱茶渥堆发酵中可降解咖啡碱真菌菌株的筛选和鉴定[J]. 茶叶科学，2017，37（2）：211-219.

[7]Heckman M，Weil J，Gonzalez D E. Caffeine （1，3，7-trimethylxanthine） in foods：a comprehensive review on consumption，functionality，safety，and regulatory matters[J]. Journal of Food Science，2010，75（3）：R77-R87.

[8]李海霞，陈 榕，周 丹，等. 咖啡因的合成及其药理作用的研究进展[J]. 华西药学杂志，2011，26（2）：182-187.

[9]李 媛，林 青. 茶碱类药物的研究进展及应用[J]. 中国医药指南，2013，11（4）：421-422.

[10]涂小珂，梁 宏，吴凤琪，等. 超高效液相色谱法同时测定茶叶中儿茶素、酚酸及生物碱[J]. 中国卫生检验杂志，2013，23（16）：3167-3169.

[11]王 伟，季晓晖，李秀峰，等. HPLC法同时测定茶叶中多酚、咖啡因和维生素C[J]. 分析试验室，2014，33（12）：1443-1446.

[12]高 俊，夏 涛，朱 博，等. HPLC-PDA对茶叶中茶氨酸、儿茶素和生物碱的同时分离检测研究[J]. 安徽农业大学学报，2008，35（3）：324-328.

[13]凌 云，赵云峰，李志军，等. 茶叶及茶饮料中儿茶素和咖啡因的多组分HPLC分析方法[J]. 卫生研究，2005，34（2）：187-190.

[14]李银花，李 娟，龚 雪，等. 高效液相色谱法同时测定茶叶中8种儿茶素、3种嘌呤碱和没食子酸[J]. 食品科学，2011，32（18）：214-217.

[15]黄 鸿，夏晓艳，赵余庆. 茶叶中茶氨酸、咖啡因和茶碱检测方法的研究进展[J]. 沈阳药科大学学报，2018，35（8）：696-706.

[16]彭 静，孙威江. 茶汤中儿茶素与生物碱测定的HPLC法及其优化[J]. 南方农业，2017，11（13）：1-6.

[17]王丽丽，陈 键，宋振硕，等. 茶叶中没食子酸、儿茶素类和生物碱的 HPLC检测方法研究[J]. 福建农业学报，2014，29（10）：987-994.

[18]馬海建，王利娟，江晨舟，等. 固相萃取-高效液相色谱法测定保健食品中8种皂苷化合物含量[J]. 江苏农业学报，2020，36（3）：743-750.

[19]李赛君. 湖南武陵山片区优质茶叶产业建设的思考[J]. 茶叶通讯，2013，40（2）：24-26.

[20]彭福元. 武陵山区宜茶的农业地质背景分析[J]. 湖南农业科学，2006（3）：55-56.

[21]常硕其，张亚莲，李赛君，等. 优质绿茶生产的理论与实践Ⅱ优质绿茶品种[J]. 茶叶通讯，2008，35（3）：16-20.

[22]张俊英，冯发青，李 霞，等. HPLC法对凤冈锌硒茶中九种品质成分的同时测定[J]. 湖北农业科学，2014，53（17）：4175-4178.

[23]中华全国供销社合作总社杭州茶叶研究院. 茶 咖啡碱测定：BG/T 8312—2013 [S]. 北京：中国标准出版社，2013.

[24]中华全国供销社合作总社杭州茶叶研究院. 茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法：BG/T 8313—2008 [S]. 北京：中国标准出版社，2008.

[25]郑 琳，高世伟. 道泉雅女茶中茶多酚和EGCG的提取工艺研究[J]. 安徽农业科学，2015，43（33）：133-136.

[26]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 食品安全国家标准 食品中铅的测定：GB/T 5009.12—2017 [S]. 北京：中国标准出版社，2017.