刺葡萄愈伤组织提取物的抗氧化活性分析

赖呈纯 赖恭梯 张静 阙秋霞 潘若 高慧颖 王琦

摘 要：以2個刺葡萄愈伤组织细胞系为材料，利用比色和分光光度法测定不同刺葡萄愈伤组织细胞培养物的总抗氧化活性，分析不同培养阶段和肉桂酸、光照条件、黑暗条件、温度（4℃、37℃）、壳聚糖、中波紫外线（UV-B）等不同处理方式对刺葡萄愈伤组织总抗氧化活性的影响。结果表明：不同培养阶段的刺葡萄红色愈伤组织花色苷和非花色苷多酚提取液均具有较强的抗氧化活性，不同培养阶段的刺葡萄红色愈伤组织花色苷提取液抗氧化活性呈双峰，最高可达7.43 U·mg-1（FW），非花色苷多酚提取液抗氧化活性最高达28.36 U·mg-1（FW），而不同培养阶段的浅黄绿色愈伤组织花色苷和非花色苷多酚提取液的抗氧化活性均非常低。经不同处理后的刺葡萄愈伤组织其花色苷和非花色苷多酚提取液总抗氧化活性存在较丰富的变化，4℃处理对于提高红色刺葡萄愈伤组织花色苷提取液抗氧化活性最为有效，而壳聚糖处理可最高效地提高非花色苷多酚提取液的总抗氧化活性。浅黄绿色愈伤组织花色苷和非花色苷多酚提取液抗氧化活性均极低，肉桂酸、光照条件、温度、壳聚糖、UV-B处理对其抗氧化活性几乎没有影响。

关键词：刺葡萄;愈伤组织;提取物;花色苷;抗氧化活性

中图分类号：S 663.1   文献标志码：A   文章编号：0253-2301（2021）06-0040-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.06.007

Abstract： In this study， by using two callus cell lines of Vitis davidii as the materials， the total antioxidant activities of different callus cell cultures of Vitis davidii were determined by using the colorimetric method and spectrophotometric method， thus to analyze the effects of different culture stages and methods such as cinnamic acid， light conditions， dark conditions， temperature （4℃， 37℃）， chitosan and ultraviolet-B （UV-B） on the total antioxidant activity of Vitis davidii callus. The results showed that the anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from the red callus of Vitis davidii at different culture stages had strong antioxidant activities. The antioxidant activity of anthocyanin extracts from the red callus of Vitis davidii at different culture stages showed double peaks， with the maximum value of 7.43 U·mg-1 （FW）， and that of non-anthocyanin polyphenol extracts was up to 28.36 U·mg-1 （FW）. However，the antioxidant activities of anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from light yellow-green callus at different culture stages were very low. The total antioxidant activities of anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from the callus of Vitis davidii under different treatments had abundant variations. The treatment with temperature of 4℃ was the most effective in improving the antioxidant activity of anthocyanin extracts from the red callus of Vitis davidii， while the treatment with chitosan was the most effective in improving the total antioxidant activity of non-anthocyanin polyphenol extracts. The antioxidant activities of anthocyanin and non-anthocyanin polyphenol extracts from light yellow-green callus were extremely low， and the treatments with cinnamic acid， illumination condition， temperature， chitosan and UVB had little effect on their antioxidant activities.

Key words： Vitis davidii; Callus; Extract; Anthocyanins; Antioxidant activity

刺葡萄Vitis davidii Fox为葡萄科葡萄属东亚种群的一个野生种[1-2]。刺葡萄果实富含酚类、黄酮、丹宁、花色苷等化合物，具有很强的抗氧化活性[3-5]。研究表明，葡萄酚类[6]、黄酮[7]、花色苷[8]和原花青素[9]等天然活性化合物对人类健康有重要的生理和药理功能，在食品、药品和化妆品工业上有广泛的应用前景。随着市场需求的不断扩大，利用植物细胞培养生产植物天然活性化合物越来越受到重视，并且有些已开始规模化生产[10]。利用刺葡萄幼胚诱导获得了2个刺葡萄愈伤组织细胞系[11]，其中红色愈伤组织富含酚类、黄酮、花色苷和非花色苷多酚等天然活性化合物[12-14]。为了进一步了解刺葡萄愈伤组织细胞培养物提取物的抗氧化活性，本研究以刺葡萄愈伤组织不同阶段细胞培养物和不同处理细胞培养物为材料，利用总抗氧化活性测定（TAOC）方法，对细胞不同提取液的抗氧化活性进行相关分析，为通过刺葡萄愈伤组织培养获得的细胞培养物的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以长期继代保持的2个刺葡萄愈伤组织细胞系为材料，其中一个愈伤组织为红色，富含花色苷和原花青素;另一个愈伤组织为浅黄绿色[11]。

1.2 试验方法

1.2.1 不同阶段刺葡萄愈伤组织的获取 2个刺葡萄愈伤组织细胞系培养20 d后，挑取生长旺盛愈伤组织，接种到附加2，4

D 1.0 mg·L-1的MS固体培养基中，于光照下培养。培养到第10 d后开始随机取样，以后每隔5 d取样1次，一直取样到第60 d，即取样时间分别为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d，共取样11次;每次随机取样21瓶，刺葡萄细胞培养物收集后均匀混合，分装后于液氮中速冻2～3 min，-80℃下保存备用。试验设3次重复。

1.2.2 刺葡萄愈伤组织不同处理与培养 2个刺葡萄愈伤组织细胞系培养20 d后，挑取生长旺盛愈伤组织，接种到附加2，4D 1.0 mg·L-1的MS固体培养基中培养。试验分别设7个处理，分别为（1）光照条件处理（CK）：于25℃ 24 h光照條件下培养25 d后，收集细胞培养物;（2）黑暗条件处理：于25℃ 24 h黑暗条件下培养25 d后，收集细胞培养物;（3）肉桂酸处理：将培养24 d的刺葡萄愈伤组织从培养瓶中取出，平铺在肉桂酸40 mg·L-1（用培养基溶解定容）浸泡过的无菌滤纸，并置于培养皿中培养1 d后收集细胞培养物;（4）壳聚糖处理：将培养24 d的刺葡萄愈伤组织从培养瓶中取出，平铺在壳聚糖800 mg·L-1（用培养基溶解定容）浸泡过的无菌滤纸，并置于培养皿中培养1 d后收集细胞培养物;（5）UV-B处理：将培养24 d的刺葡萄细胞去除瓶盖后，置于0.15 W·m-2 UV-B照射3 h后，培养1 d收集细胞培养物;（6）4℃处理：将培养24 d的刺葡萄细胞从培养室中取出，置于4℃培养24 h，收集细胞培养物;（7）37℃处理：将培养24 d的刺葡萄细胞从培养室中取出，置于37℃培养24 h，收集细胞培养物。试验另外设观察对照：将刺葡萄愈伤组织接种到附加 KT 0.5 mg·L-1和 2，4D 1.0 mg·L-1的MS培养基中，培养25 d后收集细胞培养物。各处理所获细胞培养物混合均匀后于液氮中速冻2～3 min，-80℃下保存备用。试验设3次重复。

1.2.3 制备刺葡萄愈伤组织细胞培养物提取液 花色苷提取液采用盐酸乙醇法提取，非花色苷多酚提取液用80%甲醇提取法提取，具体方法参照文献[11]。

1.2.4 总抗氧化活性（TAOC）测定 葡萄细胞提取液总抗氧化活性（TAOC）测定按照南京建成生物工程研究所、南京建成科技有限公司试剂盒操作说明进行。

1.3 数据整理与分析

试验数据采用Excel 2010进行整理分析，利用DPS软件进行方差分析和显著性检验，使用Excel 2010作图。

2 结果与分析

2.1 不同培养阶段的刺葡萄愈伤组织细胞培养物花色苷提取液总抗氧化活性

对2个刺葡萄愈伤组织培养10～60 d的细胞培养物花色苷提取液总抗氧化活性进行分析，结果如图1所示。从图1可以看出，2种刺葡萄愈伤组织的总抗氧化活性变化趋势差异很大，刺葡萄浅黄绿色愈伤组织在整个培养过程的总抗氧化水平都维持在一个很低的水平，并且随着后期细胞的衰老，总抗氧化活力会逐步降低。从刺葡萄红色愈伤组织的总抗氧化活性看，从培养10～35 d总抗氧化活力随着细胞的增殖生长先略微下降后逐渐增强，最低点在培养15 d时，为0.73 U·mg-1FW，到35 d时达到1个高峰，此时总抗氧化活力为7.12 U·mg-1FW，是最低点的9.75倍，随后迅速下降，培养40 d时总抗氧化活力为5.34 U·mg-1FW，之后又迅速上升;培养45 d时达到最高峰，为7.43 U·mg-1FW，是最低点的10.18倍;培养45～60 d，随着细胞的衰老和死亡，总抗氧化活力迅速下降，到培养60 d时总抗氧化活力只有2.50 U·mg-1FW。

2.2 不同培养阶段的刺葡萄愈伤组织细胞培养物非花色苷多酚提取液总抗氧化活性分析

2个刺葡萄愈伤组织培养10～60 d的细胞培养物非花色苷多酚提取液总抗氧化活性的分析见图2。从图2可以看出，2种刺葡萄愈伤组织的总抗氧化活性变化趋势差异很大，刺葡萄浅黄绿色愈伤组织在整个培养过程的总抗氧化水平都维持在一个很低的水平，并且变化不大。刺葡萄红色愈伤组织细胞培养物非花色苷多酚提取液的总抗氧化活性表现为先略微下降后快速增加，最低点在培养15 d时，为4.60 U·mg-1FW;培养35～40 d有一个平台区，培养45 d达到最高峰，为28.36 U·mg-1FW，是15 d时的6.17倍;培养45 d后随着细胞的衰老死亡，总抗氧化活性迅速下降，到培养60 d时只有9.00 U·mg-1FW。

2.3 不同处理下刺葡萄愈伤组织细胞培养物花色苷提取液总抗氧化活性

将2个刺葡萄愈伤组织分别经肉桂酸、光照条件、黑暗条件、温度（4℃、37℃）、壳聚糖、UVB处理后，对其花色苷提取液的总抗氧化活性进行测定，结果如图3所示。从图3可以看出，对于刺葡萄浅黄绿色愈伤组织细胞培养物，花色苷提取液中的总抗氧化活性都维持在一个较低的水平，为0.1452～0.4357 U·mg-1FW。不同处理对刺葡萄红色愈伤组织细胞培养物花色苷提取液总抗氧化活性差异较大，其中采用4℃处理的花色苷提取液总抗氧化活性最高，为3.01 U·mg-1FW，是光照条件（CK）的2.15倍;其次是壳聚糖处理，为2.58 U·mg-1FW;第3是采用37℃处理，总抗氧化活性为2.30 U·mg-1FW;随后分别为UVB（1.73 U·mg-1FW）、CK（1.40 U·mg-1FW）、肉桂酸（0.76 U·mg-1FW）和黑暗条件处理（0.08 U·mg-1FW）;黑暗条件处理的总抗氧化活性最低，远低于光照条件（CK），说明花色苷的合成需要光的参与。

2.4 不同处理下刺葡萄愈伤组织细胞培养物非花色苷多酚提取液总抗氧化活性

2个刺葡萄愈伤组织细胞培养物经肉桂酸、光照条件、黑暗条件、温度（4℃、37℃）、壳聚糖、UVB处理后的非花色苷多酚提取液总抗氧化活性进行测定，结果见图4。从图4可以看出，无论采用什么处理方式，刺葡萄浅黄绿色愈伤组织细胞培养物非花色苷多酚提取液的总抗氧化活性都极低，这也从间接说明，浅黄绿色愈伤组织合成非花色苷多酚的能力极低。从刺葡萄红色愈伤组织看，壳聚糖处理的效果最佳，总抗氧化活性达到29.80 U·mg-1FW，是CK（10.49 U·mg-1FW）的2.84倍，其次是37℃处理，总抗氧化活性为22.97 U·mg-1FW;第3是肉桂酸，为18.39 U·mg-1（FW），结合花色苷提取液分析，说明肉桂酸对花色苷合成有抑制作用，而对非花色苷多酚合成有促进作用;其后是4℃、黑暗条件、UVB。UVB对非花色苷多酚的合成有强烈的抑制作用，其总抗氧化活性远低于光照条件（CK）的总抗氧化水平。

3 结论与讨论

植物细胞提取液抗氧化活性水平高低，不仅跟提取液中抗氧化活性物质含量有关，还与提取液中不同抗氧化物质组分相关，是综合作用的结果。在蓝莓、紫薯、巨峰葡萄等提取液抗氧化活性的研究中，发现提取液抗氧化活性与提取液中抗氧化物质含量呈正相关[15]，同时在葡萄皮[16]和6个葡萄品种[17]的抗氧化活性研究中，总抗氧化活性也与提取液中抗氧化物质含量呈正相关。结合本研究前期不同阶段和不同处理的刺葡萄愈伤组织花色苷和非花色苷多酚含量变化研究[13]，发现本研究中刺葡萄愈伤组织细胞培养物提取液的总抗氧化活力无论是不同培养阶段的细胞培养物提取液，还是不同处理均与其细胞培养物提取液中花色苷和非花色苷多酚的含量成正相关，其总抗氧化活性的变化趋势与花色苷和非花色苷多酚含量变化的趋势相似。

由于刺葡萄浅黄绿色愈伤组织合成花色苷和非花色苷多酚的效率极低，或没有花色苷和非花色苷多酚的合成能力，所以其花色苷和非花色苷多酚提取液的总抗氧化活性极低，并且本研究所采用的处理方式均不能有效地增加其总抗氧化能力，其与刺葡萄红色愈伤组织细胞系合成花色苷和非花色苷多酚能力的差別，可能是基因水平上的差异，这有待今后进一步研究。在细胞培养过程中，刺葡萄红色愈伤组织细胞系出现2个花色苷合成的高峰，其花色苷提取液也相对应的有两个总抗氧化活性的高峰，并且最高的总抗氧化活性是最低的10.18倍;刺葡萄红色愈伤组织细胞系非花色苷多酚提取液的总抗氧化活性高峰也与其非花色苷多酚含量的高峰相一致，是最低点的6.17倍。本研究采用肉桂酸、光照条件、黑暗条件、温度（4℃、37℃）、壳聚糖、UVB不同方式处理刺葡萄愈伤组织发现，花色苷和非花色苷多酚含量变化比较复杂，相对应的花色苷和非花色苷多酚提取液总抗氧化活性也存在较丰富的变化，4℃处理对于提高花色苷的含量最为有效，总抗氧化活性是光照条件处理的2.15倍。而壳聚糖处理可最高效地提高非花色苷多酚的合成能力，对应的总抗氧化活性是光照条件处理的2.84倍。对总抗氧化活性的测定也进一步间接证实了肉桂酸会抑制花色苷的合成而促进非花色苷多酚的合成;而UVB的作用却与之相反，UVB可以促进花色苷的合成而抑制非花色苷多酚的合成，其作用机制有待进一步研究。参考文献：

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（责任编辑：林玲娜）