大血藤醇提物抗炎镇痛和止血活性研究初探

廖娜 黄光伟 唐红艳 周传检 杨卫豪 王恒山

摘 要： 为观察大血藤醇提物抗炎、镇痛、止血活性，该文采用75%乙醇提取制备大血藤醇提物（AESC），利用HPLC法测定其绿原酸含量;KM鼠（或新西兰兔）在测定抗炎、镇痛、止血活性时随机分为空白对照组、阳性对照组（云南白药酊组）、AESC组，依次测定其抑制二甲苯致小鼠耳肿胀度作用、痛阈值和兔肝脏局部创面损伤出血的记分分值，分别考察其抗炎、镇痛、止血作用。结果表明：AESC中绿原酸含量为（0.294 ± 0.013 5）%;与空白组比较，剂量为0.700 g·kg-1 的AESC组能显著减轻二甲苯所致的小鼠耳肿胀度（P<0.01），抑制率达26.3%;与空白组及给药前比较，剂量为1.40 g·kg-1 的AESC组均能显著提高小鼠痛阈值（P<0.01）;与空白组相比，剂量为1.40 g·kg-1的 AESC组能显著提高兔肝脏局部创面损伤出血的记分分值（P<0.001）。大血藤醇提取物具有显著的抗炎、镇痛、止血作用，有望将其开发为抗炎、镇痛、止血制剂。该结果也为大血藤的临床应用提供理论依据。

关键词： 大血藤， 抗炎活性， 镇痛活性， 止血活性， 绿原酸

中图分类号： Q946; R932  文献标识码： A  文章编号： 1000-3142（2021）07-1120-06

Abstract： To investigate the anti-inflammatory， analgesia and hemostasis effects of the 75% alcohol extract from Sargentodoxa cuneata （AESC）. The AESC was prepared by ethanol extraction， and its chlorogenic acid content was determined by HPLC. KM mice （or New Zealand rabbits） were randomly divided into the blank group， positive control group （Yunnan Baiyao Tincture group） and the AESC group in determination of anti-inflammatory， analgesia and hemostasis activities. The anti-inflammatory， analgesic and hemostasis effects were investigated through determining xylene-induced ear swelling of mice， pain threshold and rabbit liver bleeding model. The results were as follows： The content of chlorogenic acid was （0.294 ± 0.013 5）%; Compared with the blank group， AESC group （Dose 0.700 g·kg-1） could significantly reduce the ear swelling induced by xylene （P < 0.01）， and the inhibition rate was 26.3%; Compared with the blank group and before administration， AESC group （Dose 1.40 g·kg-1） could significantly increase the pain threshold of mice （P<0.01）; Compared with the blank group， AESC group （Dose 1.40 g·kg-1） could significantly improve the score of local wound bleeding （P<0.001）. The alcohol extracts of S. cuneata showed significant effects in anti-inflammatory， analgesic and hemostasis， could be developed as the anti-inflammatory， analgesic， hemostatic agents. And this study will provides theoretical basis for clinical application of the S. cuneata.

Key words： Sargentodoxa cuneata， anti-inflammatory activity， analgesia activity， hemostasis activity， chlorogenic acid

大血藤（Sargentodoxa cuneata）為木通科（Lardizabalaceae）大血藤属（Sargentodoxa）植物。据2015年版《中国药典》记载，大血藤具有清热解毒、活血、祛风止痛等功效。近年来，大血藤水提物（李华等，2013）、乙酸乙酯部位（陈香君等，2017）、多糖（Guo et al.， 2018）等组分均具有抗炎作用。大血藤化学成分3，4-二羟基苯乙醇苷对DSS诱导的结肠炎具有保护作用（Li et al.， 2019）。大血藤水提物能抑制二甲苯引起小鼠耳廓肿胀，减轻肿胀度和肿胀率而具有抗炎作用;延长醋酸致疼痛模型小鼠痛阈潜伏期和减少扭体次数，抑制小鼠肉芽组织增生而具有镇痛作用（李华等，2013）。

现代医学主要集中在大血藤水提物、乙酸乙酯部位等的抗炎作用研究。大血藤不仅是风湿痹痛特效药，还具有治疗肠痈腹痛、热毒疮疡、经闭、痛经、崩漏、跌扑肿痛等作用。据文献记载，大血藤服用方法有煎汤、研末、浸酒。本课题组认为，不仅大血藤的水提物具有抗炎活性，其醇提物在抗炎、镇痛和止血方面也具有一定的开发前景。因此，本研究以大血藤醇提物（AESC）为研究对象，采用二甲苯致炎的小鼠耳肿胀度模型，热板法及兔肝脏局部创面损伤出血模型，初步评价其醇提物抗炎、镇痛、止血药理活性，并建立HPLC法测定其中绿原酸含量，为开发大血藤抗炎、镇痛、止血制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材及动物 大血藤的干燥藤茎，产地为湖北，由湖南中医药大学张琴副教授鉴定。SPF级昆明小鼠，体重18～22 g，雌雄各30只，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号：SCXK桂2014～0002）;健康新西兰兔，普通级，体重2.0～2.5 kg，由广西广得生物科技有限公司提供（许可证号：SCXK桂2017～0001）。动物实验获得了广西壮族自治区中医药研究院实验动物伦理委员会的批准。

1.1.2 试剂和仪器 试剂：云南白药酊（云南白药集团股份有限公司生产，批号ZFE1703）;绿原酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110753-201716）;乙腈（Fisher），磷酸（天津科密欧化学试剂有限公司），均是色谱纯。

仪器：FA1004型电子分析天平（上海精科天平厂）;GJ-8402型热板测痛仪（宁海白石电子医药仪器厂）;Agilent 1200 VWD 液相色谱仪;梅特勒托利多ML204 电子天平。

1.2 方法

1.2.1 AESC的制备 大血藤药材，粉碎，称取300.0 g，液料比1∶10，温度为80 ℃，75%乙醇回流提取，过滤，浓缩，重复提取2次，将提取液浓缩至无醇味，冷冻干燥，用10%乙醇溶解，备用。

1.2.2 AESC中绿原酸含量测定

1.2.2.1供试品和对照品溶液的制备 精密称定AESC，于锥形瓶中用少量甲醇溶解，移入50 mL容量瓶，用甲醇定容，摇匀，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，即得供试品溶液;精密称取6.3 mg绿原酸对照品，溶解，移入50 mL容量瓶，定容得126 μg·mL-1的绿原酸母液。

1.2.2.2 色谱条件 液相色谱条件：Kromasil C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm， 5 μm）;紫外检测器波长325 nm; 进样量20 μL; 流量1 mL·min-1; 柱温30 ℃; 流动相为0.05%磷酸溶液（A）-乙腈（B）;梯度洗脱[15%→18%（B），0～10 min;18%→20% （B），10～15 min。]

1.2.2.3 线性关系考察 精密吸取上述配制的绿原酸母液0.1、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL依次置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，并依照“1.2.2.2”色谱条件测定。

1.2.2.4 绿原酸含量测定方法学考察 取同一批号的供试品6份，精密称定，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，制备供试品溶液，按“1.2.2.2”色譜条件实验，测定样品中绿原酸的含量相对标准偏差（RSD），考察重复性;取浓度18.9 μg·mL-1的对照品溶液，按“1.2.2.2”色谱条件连续测定6次，计算峰面积RSD值，考察精密度;取同一批号的供试品，精密称定，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，制备供试品溶液，于0、2、4、6、8 h按“1.2.2.2”色谱条件测定含量，共测5次，考察稳定性;精密称取已知绿原酸含量的供试品，共取6份，置10 mL容量瓶中，精密加入绿原酸对照品，定容于10 mL容量瓶。按“1.2.2.2”色谱方法测定回收率。

1.2.2.5 AESC中绿原酸含量测定 依次精密吸取3份供试品溶液20 μL，按“1.2.2.2” 色谱条件进样，根据绘制的线性方程计算AESC中的绿原酸的含量。

1.2.3 药理活性研究

1.2.3.1 抗炎作用研究 参照文献（Chen et al.， 2019;Li et al.， 2020;梁天坚等，2020）的方法，略有改进。选取体重18～22 g健康昆明种雄性小鼠30只，每组10只，随机分3组，设定空白组（溶剂组）、云南白药酊组、AESC组。在小鼠右耳廓内外两面均匀涂抹100 μL二甲苯，左耳不涂。30 min后，各组小鼠右耳涂抹给药，空白对照组给予5.00 g·kg-1溶剂，阳性对照组给予5.00 g·kg-1云南白药酊，AESC组给予0.700 g·kg-1 AESC。1 h后，处死小鼠，清理左右耳，剪下左右耳廓，打孔，依次称重，并按式（1）和式（2）计算肿胀度及肿胀抑制率。

肿胀度（mg）=右耳耳片质量-左耳耳片质量（1）

抑制率（%）=

（空白组平均肿胀度-给药组平均肿胀度）空白组平均肿胀度×100（2）

1.2.3.2 镇痛作用研究 采用略微改良的热板法 （曹玫等，2013;Yuan et al.， 2019;Li et al.， 2020），（55 ± 0.1） ℃热板，以小鼠自投热板至舔后足所需时间作为痛阈值。选取小鼠的痛阈值在5～30 s之间，体重18～22 g健康昆明种雌性小鼠30只，随机分3组，每组10只，依次设定为空白组（溶剂组）、云南白药酊组、AESC组，测定小鼠给药前的正常痛阈值2次。随后，空白对照组给予5.00 g·kg-1溶剂，阳性对照组给予5.00 g·kg-1云南白药酊，AESC组给予1.40 g·kg-1 AESC涂敷于每只动物的4个足跖，依次在15、30、45 min测定小鼠的痛阈值。

1.2.3.3 止血作用研究 参照文献（Chen et al.， 2016; Shefa et al.， 2019; Wei et al.， 2020）的方法进行实验。取健康体重为2.0～2.5 kg新西兰兔15只，雌雄兼用，随机分为3 组，设定为空白对照组（5.00 g·kg-1溶剂）、云南白药酊组（5.00 g·kg-1）、AESC组（1.40 g·kg-1）。以30 mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉后，仰卧固定于手术台上，消毒，开腹，在肝左叶制作长、宽、高均约1 cm创口，擦去喷出的血后，样品涂于纱布上涂敷于创口上给药，每30 s观察1次，记录时间，如超过3 min仍然出血，则记为未能止血，止血时间记为>3 min。每只动物进行4次肝脏局部创面损伤止血实验。3个样品按拉丁方程序敷药，每个样品总计进行20次止血实验。止血效果按倒数计分法（10/T）记为分值F，3 min以上未能止血，F无分值记为0。

1.2.4 数据处理 数据采用Excel 2010和SPSS 20软件进行处理，实验数据以x ± s表示，组间均数比较采用t 检验，P<0.05有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 AESC中绿原酸含量测定

2.1.1 綠原酸标准曲线 在“1.2.2.2”色谱条件下，标准品和AESC样品中绿原酸峰形和分离度较好，且色谱峰保留时间一致。以浓度（μg·mL-1）-峰面积进行线性回归，求得回归方程：y=28.556 2x-5.154 4，r=0.999 7。绿原酸在1.26～31.5 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.1.2 绿原酸含量测定方法学考察 按“1.2.2.2”色谱条件进行平行实验，测定取同一批号的6份供试样品，其RSD为0.34%，这表明本实验方法重复性良好。连续测定6次标准品，RSD为0.63%，这表明仪器精密度良好。于0、2、4、6、8 h测定的绿原酸含量RSD为0.12%，这表明绿原酸日内稳定性良好。绿原酸的加标回收率为95.42%，RSD值为1.60%，该结果显示本实验方法的回收结果准确可靠。

2.1.3 AESC中绿原酸含量 按“1.2.2.2”色谱条件进样，并根据绘制的线性方程计算AESC样品中的绿原酸的含量，含量为（0.294±0.013 5）%。

2.2 药理实验结果

2.2.1 抗炎实验结果 由表1可知，与空白组比较，AESC剂量组能显著减轻二甲苯所致的小鼠耳肿胀度（P<0.01），抑制率为26.3%，与阳性对照云南白药酊组抑制率（26.9%）相当。结果表明，AESC组具有极显著的抗炎作用。

2.2.2 镇痛实验结果 由表2可知，与空白组比较，在给药15、30、45 min时，AESC能极显著提高小鼠痛阈值（P<0.01）;与给药前比较，AESC能显著提高小鼠痛阈值（P<0.01）。结果表明AESC组具有极显著的镇痛作用。

2.2.3 止血实验结果 由表3可知，与空白组比较，AESC对兔肝脏局部创面损伤出血有极显著的止血效果（P<0.001），表明AESC具有极显著的止血作用。

3 讨论与结论

大血藤具有清热解毒、活血、祛风止痛等功效，其药材质量控制受到广泛关注。然而，目前大血藤醇提物质量控制方法研究较少。本研究建立的大血藤醇提物中绿原酸的HPLC测定方法，该方法简便、快速、准确、重复性好，可用于大血藤醇提取物绿原酸的含量测定。绿原酸是大血藤药材的重要指标成分（Li et al.， 2016），是多种植物中的抗炎功效成分（Torres-rêgo et al.， 2016; Huang et al.， 2017; Chen et al.， 2017）。因此，通过测定大血藤醇提物中绿原酸的含量，用于其质量控制，为开发利用大血藤提供理论依据。

本实验通过测定二甲苯致小鼠耳肿胀度和痛阈值，考察大血藤醇提物抗炎和镇痛活性。实验结果表明，大血藤醇提物能显著减轻二甲苯所致的小鼠耳肿胀度;与空白组及给药前比较，其均能显著提高小鼠痛阈值。本研究结果表明大血藤醇提物具有与云南白药酊相当的抗炎和镇痛作用，这为AESC民间采用浸酒法用于祛风止痛、痛经、跌扑肿痛提供理论依据。本实验测定了兔肝脏局部创面损伤出血的止血时间，结果显示，与空白组相比，AESC能显著提高兔肝脏局部创面损伤出血的记分分值，显示AESC具有极显著的止血活性。这为AESC民间用于崩漏提供了理论依据，也为其在临床上用于治疗子宫内膜异位症和慢性盆腔炎（何苗，2017;郑亚玲，2010）提供了理论指导。大血藤醇提物有望开发成类似云南白药的跌打损伤药，或是具有抗炎、镇痛、止血活性的口腔护理用品（Kharaeva et al.， 2020）。然而，大血藤的镇痛、止血活性功效物质基础及其相应的作用机制尚未明确，仍需深入研究。

综上所述，大血藤醇提物具有显著的抗炎、镇痛、止血活性。本研究建立了AESC的质量控制方法，优化了提取工艺，有望开发成抗炎、镇痛、止血制剂。

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注： ### 表示与空白对照组比较，记分分值差异极显著。

Note： ### represents extremely significant differences in scores compared with blank group （P<0.001）.

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（责任编辑 何永艳）