蜘蛛香中绿原酸及总酚酸的含量测定

刘开萍+杨军+罗喜荣+赵开坤+尹航+刘兴赋

摘要：试验建立了蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）中绿原酸和总酚酸的含量测定方法。利用高效液相色谱法（HPLC）测定蜘蛛香中绿原酸的含量，色谱柱为Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），流速1.0 mL/min，检测波长327 nm，柱温30 ℃；以绿原酸为对照品，采用紫外-可见分光光度法（UV）在327 nm波长处测定蜘蛛香中总酚酸的含量。结果表明，绿原酸在2～20 μg/mL范围内浓度与峰面积线性关系良好，r=0.999 6，加样回收率为97.95%，RSD为1.37%；总酚酸在5～20 μg/mL范围内浓度与吸光度线性关系良好，r=0.999 8，加样回收率为100.31%，RSD为1.34%。该方法简便、快速、准确、重复性好，可用于蜘蛛香中绿原酸和总酚酸的含量测定。

关键词：蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）；绿原酸；总酚酸

中图分类号：Q949.781.4+7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）02-0288-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.02.021

蜘蛛香又名马蹄香、老虎七、心叶缬草等，系败酱科（Valerianaceae）缬草属（Valeriana L.）植物蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）的干燥根茎及根，在中医里具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿、镇静安神等功效，主治脘腹胀痛、食积不化、腹泻痢疾、风湿痹痛、腰膝酸软、失眠等症，主要含有挥发油、缬草三酯类、黄酮类、多酚类等成分[1-8]。蜘蛛香药材的质量控制目前尚不完善，为此，试验分别采用高效液相色谱法（HPLC）和紫外-可见分光光度法（UV），首次测定了蜘蛛香植株中绿原酸及总酚酸的含量，旨在为蜘蛛香药材资源的合理开发利用以及質量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 蜘蛛香植株分别采自贵州省贵阳市、江口县、松桃苗族自治县、岑巩县、石阡县，自然阴干后，粉碎过60目筛，备用。绿原酸对照品来自中国食品药品检定研究院，批号110753-201314；乙腈为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器 主要有Agilent 1100 DAD高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；UV-1750紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；EL204电子天平（梅特勒-托利仪器上海有限公司）；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）。

1.2 溶液的配制

1.2.1 对照品溶液 精密称取适量绿原酸对照品，用50%甲醇配成200 μg/mL的贮备液。分别取不同体积的绿原酸标准贮备液于10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，配制成系列浓度的标准工作溶液。

1.2.2 供试品溶液 准确称取各地0.5 g蜘蛛香样品，用石油醚回流脱脂至提取液无色，残渣挥干石油醚后置具塞锥形瓶中，加入50%甲醇50 mL，密塞，摇匀，称定质量；超声提取40 min，放冷，用50%甲醇补足减失的质量；过滤，取续滤液0.2 mL，加50%甲醇稀释、定容至10 mL，即得。

1.3 绿原酸的测定

色谱柱为Dikma C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液（12∶88），流速1.0 mL/min，检测波长327 nm，柱温30 ℃，进样量20 μL。以标准品的保留时间和峰面积定性、定量测定样品中的绿原酸含量。

1.4 总酚酸的测定

以50%甲醇作空白，在紫外-可见分光光度计的最大吸收波长处测定标准工作溶液的吸光度，绘制工作曲线，以相同条件测定样品液的吸光度，计算样品中的总酚酸含量。

2 结果与分析

2.1 绿原酸测定

2.1.1 色谱分析 绿原酸对照品和供试品色谱结果见图1。从图1可见，在上述色谱条件下，绿原酸可有效分离，峰型对称，无杂峰干扰。

2.1.2 标准曲线 精密移取绿原酸标准贮备液 0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，按上述色谱条件依次进样，测定峰面积。以绿原酸浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y）进行线性回归拟合，得回归方程y=9.513 4x-0.380 5，r=0.999 6，表明绿原酸在2～20 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

2.1.3 精密度试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6次，测得绿原酸峰面积RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。

2.1.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样，测得绿原酸峰面积RSD为1.43%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 重复性试验 取同一批（贵阳市样品）蜘蛛香样品6份，先按上述方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件测定，测得绿原酸平均含量为20.53 mg/g，RSD为1.26%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 加样回收率试验 精密称取已知绿原酸含量的蜘蛛香样品6份，准确加入等量的对照品，按上述方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件测定，结果平均回收率为97.95%，RSD为1.37%，表明该方法准确度良好。

2.2 总酚酸测定

2.2.1 测定波长的选择 分别取对照品溶液和供试品溶液在紫外-可见分光光度计的200～400 nm范围内进行扫描，结果见图2。图2表明，对照品溶液及供试品溶液均在327 nm处有最大吸收，故选择总酚酸测定波长为327 nm。

2.2.2 工作曲线 精密移取总酚酸标准贮备液 0.25、0.40、0.55、0.70、0.85、1.00 mL分别置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，在327 nm处测定吸光度。以总酚酸浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，得回归方程为y=41.867x-0.020 8，r=0.999 8，表明在5～20 μg/mL范围内总酚酸浓度与吸光度具有良好的线性关系。

2.2.3 精密度试验 取同一供试品溶液在327 nm处测定吸光度，重复测定6次，结果RSD为0.85%，表明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h在327 nm处测定吸光度，结果RSD为1.04%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 重复性试验 取同一批（贵阳市样品）蜘蛛香样品6份，按上述方法制备供试品溶液，在327 nm处测定吸光度，测得总酚酸平均含量为37.12 mg/g，RSD为1.15%，表明方法重复性良好。

2.2.6 加样回收率试验 精密称取已知总酚酸含量的蜘蛛香样品6份，准确加入等量的对照品，按上述方法制备供试品溶液，在327 nm处测定吸光度，结果平均回收率为100.31%，RSD为1.34%，表明方法准确度良好。

2.3 样品测定

取不同产地的蜘蛛香样品，按上述方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件测定，计算样品中的绿原酸含量；在紫外-可见分光光度计的327 nm处测定吸光度，计算样品中的总酚酸含量，结果见表1。

3 讨论

蜘蛛香是惟一被2015年版《中国药典》收录的缬草类生药，是一味中医临床长期应用疗效较好的中药，具有抗肿瘤、保护神经、保肝、抗氧化、抗菌、抗病毒等药理作用[9]。试验建立了蜘蛛香中绿原酸及总酚酸含量的检测方法，该方法简单、快捷、重现性好、准确可靠，可用于蜘蛛香药材的质量控制及定量分析，为蜘蛛香药材质量标准的提升打下了基础。

绿原酸广泛分布于植物中，但含量较高的植物不多。试验测定了黔产蜘蛛香中绿原酸及总酚酸的含量。结果表明，酚酸类化合物是蜘蛛香中含量较高的一类物质，是其发挥临床疗效的重要物质基础，具有较高的研究和开发利用价值。

参考文献：

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[2] 杨 军，龙庆德，罗喜荣，等.超临界二氧化碳萃取蜘蛛香油工艺的研究[J].时珍国医国药，2012，23（1）：157-158.

[3] 田弋夫，龙庆德，罗喜荣，等.蜘蛛香油化学成分的气相色谱-飞行时间质谱分析[J].时珍国医国药，2012，23（4）：924-926.

[4] 罗喜荣，罗 俊，杨 军，等.蜘蛛香不同部位中总缬草三酯含量测定[J].安徽农业科学，2012，40（16）：8884，9106.

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[6] 罗喜荣，苑天红，杨 军，等.超临界CO2萃取蜘蛛香中缬草素工艺优化[J].湖北农业科学，2013，52（8）：1901-1902，1912.

[7] 李 蓉，李小平，吴 莹.紫外分光光度法测定蜘蛛香中总黄酮的含量[J].辽宁中医药大学学报，2008，10（12）：149-150.

[8] 傅 亮，楚清脆，黄宝康，等.毛细管电泳-电化学检测法测定蜘蛛香中多元酚类化合物[J].分析化学，2005，33（2）：161-164.

[9] 陈 畅，李韶菁，唐仕欢，等.蜘蛛香藥理研究进展[J].中国中药杂志，2012，37（14）：2174-2177.