黄芪甲苷对特发性胃瘫大鼠c-kit蛋白表达及Cajal间质细胞的影响*

姚 奇，周 茜，任东林，万星阳△

（1.深圳市人民医院肛肠外科，深圳 518020；2.中山大学附属第六医院肛肠外科，广州 510655）

胃瘫综合征（gastroparesis）是指在无明确机械性梗阻的情况下出现的胃排空延迟，主要症状包括腹胀、恶心呕吐、过早的饱腹感，其中特发性胃瘫（idiopathic gastroparesis，IG）占50%以上[1]。Cajal间质细胞（interstitial cells of Cajal,ICC）是一种特殊的间质细胞，能够产生生理慢波、控制胃肠道平滑肌的收缩和蠕动，被认为是胃肠道平滑肌的起搏细胞[2]。ICC 的表型或数量变化是多种胃肠动力紊乱性疾病的主要因素，与IG 的发生密切相关[3]。胃肠道的ICC数量往往通过c-kit蛋白表达检测来体现，c-kit 受体是胃肠道ICC 特异性标志物[2,4-5]。中药黄芪在胃瘫中可发挥独特的治疗作用，并有研究表明，黄芪可通过刺激消化道ICC 的c-kit 表达，维持ICC的表型及数量稳定[5-6]。本研究采用洛派丁胺构建IG大鼠模型，经黄芪甲苷灌胃处理后通过组织免疫荧光法检测大鼠胃组织中c-kit的表达水平，评估其对ICC 数量及表型的影响，在动物水平探究黄芪甲苷对IG的治疗作用及其潜在机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

24 只SPF 级Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，年龄6～8 周，体重100～130 g，购于中山大学实验动物中心，合格证号：SCXK（粤）2016-0029。实验前稳定饲养1周，控制动物房温度25 ℃，相对湿度50%，昼夜时间分明，不禁食、不禁水。

1.2 主要试剂与设备

黄芪甲苷（纯度为98%，成都德斯特生物科技有限公司）用生理盐水稀释为73 mg/kg；CD117（ckit）兔单克隆抗体（14-1172-81，Introgen，美国）；山羊抗兔Cy3 荧光二抗（SA00009-1，Proteintech，湖北）；含40,6-二mid 基-2-苯基吲哚的荧光固定剂（ZLI-9557；ZSGB Bio，北京）；5%山羊血清封闭液（SL038，Solarbio，北京）；温恒温器（CM3050S；Leica Microsystems，Wetzlar，德国）；激光共聚焦扫描显微镜（TCS-SP8，徕卡系统显微系统贸易有限公司，上海）。

1.3 构建胃瘫大鼠模型

将24 只健康的SPF 级SD 大鼠，随机分为空白组、模型组、黄芪甲苷低剂量组和黄芪甲苷高剂量组，每组6只。除空白组外，其余各组均给大鼠灌胃10 mg/kg 洛派丁胺，连续5 d，构建IG 模型，空白组等体积生理盐水灌胃。造模5 d后，大鼠体重、进食量明显降低、活动减少[5]，模型组继续灌胃洛派丁胺混悬液，低剂量组和高剂量组在造模的同时分别给予32 mg/kg、64 mg/kg黄芪甲苷进行治疗，空白组给予等体积生理盐水，连续5 d。

1.4 观察指标

记录每日大鼠的精神状态、体重、进食量、饮水量。胃瘫大鼠模型构建效果通过胃排空率及胃重量评估。

1.4.1 酚红胃排空测定及胃称重 大鼠取材前禁食12 h，期间自由饮水。随机每组选择3 只大鼠，0.05%的酚红溶液以500 μL/只的体积灌胃，30 min后水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉放血处死大鼠，立即取全胃称重。胃浸泡于5 mL氢氧化钠溶液和0.5 mL 三氯乙酸溶液中，3 000 r/min 的速度匀浆20 min，取上清液1 mL 加入4 mL 的氢氧化钠溶液中，分光光度计测定胃排空值：

胃排空率（%）=（1-X/Y）×100

X：胃内残留酚红溶液的吸光度

Y：酚红与氢氧化钠混合溶液的吸光度

1.4.2 胃组织结构观察及苏木精―伊红（HE）染色 随机每组取3只大鼠，处死大鼠并解剖，自贲门上1 cm至幽门下1 cm，取全胃，组织分为两份，一份固定于10%福尔马林中，分级酒精脱水，石蜡包埋，一份冰冻于-80 ℃冰箱。切片厚度3～5 μm，切片置于载玻片上，脱蜡后用苏木精、伊红染色，用中性树脂封片，盖上盖玻片，观察组织形态。

1.4.3 组织免疫荧光染色 60 ℃烘箱内烤片1 h，依次向石蜡切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95%酒精、85%酒精、75%酒精内洗去多余石蜡。以柠檬酸钠抗原修复液修复抗原，将0.3% Trition 和0.1% Tween 溶于PBS，通透细胞膜。25°C 环境下用5%山羊血清封闭非特异性结合位点1 h，将标本在4 ℃下与c-kit 一抗（1∶200）稀释液孵育过夜，然后与Cy3 偶联的山羊抗兔荧光二抗（1∶300）稀释液孵育。在25 ℃的黑暗环境中放置1 h，PBS 清洗3 次后DAPI 孵育20 min。样品用荧光固定剂固定，并在激光共聚焦扫描显微镜下观察并拍照记录。通过Image J软件进行荧光半定量，每组平均单位荧光密度使用GraphPad Prim6软件进行数据分析。

1.4.4 蛋白质免疫印迹实验 冰冻大鼠胃组织解冻后除去黏膜部分，取胃固有肌层研磨、匀浆，加入RIPA 裂解液提取蛋白后定量蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转印至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h 后孵育一抗（1∶1 000）稀释液，置于4 ℃冰箱过夜，第2 天孵育相应的二抗（1∶5 000）稀释液1 h后进行ECL（Pierce）孵育后显影。

1.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0 统计软件包对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用方差分析，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄芪甲苷对胃瘫大鼠胃重量及胃排空率的影响

大鼠造模第5 天，模型组和黄芪甲苷各剂量组小鼠可见饮水量和饮食量较空白组略微下降，但无明显差异，各组大鼠的精神状态也无明显差异（均P＞0.05）。予黄芪甲苷干预5 d后取材可见，模型组胃重量对比空白组明显增加，排空率显著下降，模型构建成功。与模型组比较，黄芪甲苷高剂量组胃重量较模型组明显下降，胃排空率明显上升（P＜0.05），而黄芪甲苷低剂量组胃重量与排空率与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组胃重量及胃排空率比较

表1 各组胃重量及胃排空率比较

与模型组比较，*P＜0.05。

2.2 胃瘫大鼠模型胃组织结构及Cajal细胞形态及分布

HE 染色可见黄芪甲苷可减轻胃瘫大鼠胃组织中的炎性细胞浸润，减轻固有肌层的水肿、增厚。组织免疫荧光法染色后于荧光显微镜下观察，c-kit表达集中于黏膜层和固有肌层（图1A）。黏膜肌层多为圆形、环细胞核红染，可识别为肥大细胞。Cajal 细胞多位于固有肌层，空白组Cajal 细胞形态与实验组类似，单个细胞呈梭状形态，环细胞核红染，多个细胞呈网状交织分布，紧密环绕神经节。模型组c-kit 荧光强度明显降低，Cajal 细胞数量减少，形态边缘圆钝，少见交叉相连（图1B）。

图1 胃瘫大鼠模型胃组织结构及Cajal细胞形态及分布

2.3 黄芪甲苷对大鼠胃组织中Cajal细胞的影响

通过Image J 软件对组织免疫荧光染色进行荧光半定量统计，平均每个200×视野下固有肌层c-kit荧光强度比较，结果表明，与空白组比较，模型组平均荧光强度明显下降（0.313±0.071vs0.532±0.084，P=0.016）；与模型组比较，高剂量组显著回升（0.487±0.034vs0.313±0.071，P=0.049），而空白组无明显差异（0.487±0.034vs0.532±0.084，P=0.631），低剂量组也无明显差异（0.314±0.065vs0.313±0.071，P=0.999）。通过免疫印迹实验检测各组大鼠胃固有肌层组织内c-kit表达量，空白组平均c-kit表达最高，胃瘫模型组c-kit 表达量明显下降，黄芪甲苷可部分回调c-kit表达量，维持ICC表面c-kit的稳定表达（图2）。

图2 黄芪甲苷对胃瘫大鼠胃组织ICC改变的影响

3 讨论

目前，IG最常用的治疗方式为控制热量及营养摄入等生活习惯调节，促胃动力剂、止吐药剂神经调节剂等药物及在症状较为严重的情况下采用手术治疗。研究报道，仅有约2%的胃瘫患者严格遵从饮食调节建议，药物使用也受肝脏、肾脏损害等副作用局限，IG 的治疗效果差强人意，漫长而反复的治疗过程对IG 患者的身心健康和生活质量都造成了较大的影响[6]。而中医药中许多复方制剂和针灸疗法治疗胃瘫综合征历史悠久且具有独特优势，在临床应用中取得了良好的效果[7-8]。然而，IG发病的机制十分复杂，中药促胃动力的机制涉及胃肠运动的几乎所有的调节环节和因素，其作用机制并不明了。因此，本研究拟从传统中草药宝库中挖掘治疗胃瘫的新型药物，并探讨其治疗IG的潜在机制。

中医认为，胃瘫属于“呕吐”、“反胃”的范畴，主要由于胃失和降、气逆于上引起，其中医辨证主要包括脾胃虚弱、脾肾阳虚及胃阴不足。IG多为胃气不足、功能减退的病理变化，因饮食不节、损伤胃气，或素体虚弱、久病胃气不复等所致。黄芪为豆科植物，主要药理作用是“益气固表”。黄芪用于治疗胃瘫综合征历史悠久，《伤寒杂病论》中提到，黄芪建中汤、防己黄芪汤、乌头汤等黄芪类经方可用于胃瘫综合征，并经研究证实[9]。ICC 的表达对胃瘫、便秘等胃肠紊乱型疾病的发生发展产生了重要影响，胃瘫患者或动物模型中均可见ICC 的数量显著减少或表型改变。据报道，黄芪可增强肌条的收缩幅度，能使糖尿病性胃轻瘫大鼠胃组织中ICC 形态和数量向正常转化，使c-kit mRNA的表达数量增多[10]。这些研究表明，黄芪复方药方可通过保护结肠ICC促进胃动力，治疗IG，但其复方成分复杂，经机体吸收、代谢后发挥治疗作用的成分并不明确。随着提取、纯化技术的逐渐成熟，黄芪皂苷的成分之一，黄芪甲苷被认为是黄芪皂苷中生物利用度最高的成分，黄芪甲苷或许是黄芪改善胃瘫症状的关键[11]。

本研究结果显示，造模后模型组排空率显著下降，已成功构建胃瘫大鼠模型。实验组使用黄芪甲苷处理后，发现黄芪甲苷可减少胃重量、增加胃瘫大鼠胃排空率（P＜0.05）。组织免疫荧光法检测结果显示，不同组中c-kit阳性细胞主要分布于黏膜层及固有肌层。根据c-kit 染色特性及细胞的形态可基本判断，黏膜层中呈椭圆形的c-kit阳性细胞为肥大细胞，ICC表现为多突触的梭形结构，相邻ICC互相交织呈网状结构，集中分布于胃固有肌层。而模型组中，Cajal 细胞形态边缘圆钝，细胞之间少见交叉相连。荧光强度分析及蛋白质免疫印迹可见，模型组固有肌层中的c-kit 表达量，较对照组明显下降，黄芪甲苷可显著增加胃固有肌层中的c-kit表达（P＜0.05）。c-kit是位于5号染色体位点上的原癌基因，它编码kit受体（即CD117），是一种酪氨酸蛋白激酶受体，可被ICC 广泛表达并通过与其天然配体干细胞因子（stem cell factor，SCF）结合，调控MAPK、Wnt、NF-κB 等信号通路，决定着细胞的表型及分化，被认为是胃肠道ICC 的特异性标志物[12]。研究大量研究表明，便秘、肠易激综合征等胃肠动力紊乱疾病中，c-kit阳性细胞显著降低，ICC的表型及数量在维持一定胃肠动力中发挥着至关重要的作用[13]。c-kit 表达增高可促进细胞增殖，c-kit 的缺失可导致ICC 失去释放慢波的特性，逐渐分化为平滑肌细胞[14]。并且，当c-kit刺激增加，ICC向肌细胞分化的过程可被一定程度上逆转，这种ICC 与肌细胞之间的双向分化作用或是胃肠动力紊乱治疗的关键，寻找能够维持ICC细胞c-kit表达的治疗手段是本研究的主要目的。

总之，本研究通过动物建模观察黄芪甲苷的促胃动力作用、胃组织病理结构及c-kit阳性细胞的表达，发现黄芪甲苷可促进ICC表达c-kit，一定程度上逆转ICC 向肌细胞分化的趋势，使胃瘫大鼠胃组织中总体c-kit表达上升，明显增加了固有肌层中c-kit阳性细胞的数量，增加胃排空率，从而改善IG 症状。黄芪甲苷可有效促进胃动力，或可成为IG治疗的新型单体药物。