杜仲黄酮对糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的影响*

范春惠，张琳惠，郑 妮

（1.浙江大学医学院附属儿童医院，杭州 310000；2.南方科技大学医院，深圳 518000）

线粒体是机体进行氧化磷酸化、氧化代谢的细胞器，其为机体的生命活动合成机体必须的能量物质腺苷三磷酸（ATP），同时具有调控活性氧（ROS）依赖的胞内信号，参与细胞凋亡和自噬等生理作用[1]。2型糖尿病（T2DM）是因胰岛组织生理或病理缺陷而造成β 细胞分泌胰岛素不足，造成血糖升高。研究发现，T2DM 的出现与胰腺线粒体发生异常、线粒体氧化酶活性和肌肉脂质代谢水平降低有密切关系[2]。因此，寻找改善线粒体作用的药物对于T2DM的防治具有重要的意义。

杜仲黄酮是从杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）的干燥树皮中提取的主要成分。有研究表明，杜仲黄酮对糖尿病及糖尿病肾病小鼠均有良好的治疗作用[3-4]，但其具体机制尚未阐明。因此，本研究通过尾静脉注射链脲佐菌素（STZ）联合高脂高糖饮食共同诱导构建糖尿病小鼠模型，探讨杜仲黄酮对糖尿病小鼠胰腺线粒体功能的影响，为T2DM的防治提供新思路及基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性昆明小鼠，SPF 级，18～22 g，购自浙江大学实验动物中心，合格证号：SCXK（浙）2019-0023。小鼠饲养于通风良好的环境，室温18～25 ℃，相对湿度40%～70%，12 h/12 h 光照昼夜循环。实验开始前所有动物适应性喂养1周。

1.2 药物与试剂

采用醇提取法提取杜仲黄酮：首先将干燥杜仲进行充分粉碎，粉碎药材置于容器中采用70%乙醇（药材∶70%乙醇=1∶15），80 ℃加热回流提取2 h，连续提取3次。将提取液进行过滤浓缩获得干燥杜仲黄酮提取物。盐酸二甲双胍片（京丰制药有限公司，批号：191115）；STZ（美国Sigma 公司）；高脂高糖饲料（武汉万千佳兴生物科技有限公司，批号:20191113）。总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、ROS、ATP 酶、ATP含量、线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ（ComplexI、Ⅲ）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；线粒体融合素1（Mfn1）、NF-E2 相关因子1（NRF1）抗体（英国Abcam公司）。

1.3 主要仪器

罗氏卓越型血糖仪（瑞士ACCU-CHEK Performa）；9602A-酶标仪（北京艾普生物设备有限公司）；Mini-Protean Tetra 垂直电泳仪、转膜显影设备、Gel-Doc EZ 凝胶电泳成像分析系统（美国Bio-Rad 公司）。

1.4 造模与分组[5]

小鼠尾静脉注射STZ（25 mg/kg）1次，高脂高糖饲料喂养8 周后检测小鼠空腹血糖（FBG），FBG≥11.1 mmol/L 为T2DM 模型成功。将T2DM 模型小鼠随机分为模型组、二甲双胍组、杜仲黄酮低剂量组、杜仲黄酮高剂量组，每组10 只。另以健康昆明小鼠为空白对照组。二甲双胍组予32 mg/kg 二甲双胍混悬溶液，杜仲黄酮高、低剂量组分别予160 mg/kg、80 mg/kg杜仲黄酮混悬溶液，各组灌胃予相对应药物60 d，1次/d。模型组和正常对照组小鼠灌胃予等体积生理盐水。

1.5 观察指标

分别于给药前及末次给药2 h 后，血糖仪检测FBG。眼眶静脉采集小鼠血液，离心，取血清待测。切除部分胰腺组织，制备成10%的匀浆液。另切取部分胰腺组织，-80℃保存待测。

1.5.1 血清胰岛素（FNS）、抗氧化因子及FBG检测 将分离所得的血清复溶，采用ELISA 法，按说明书操作分别检测血清中FNS、T-AOC 含量及SOD、CAT活性。

1.5.2 胰腺中线粒体功能因子及ROS 检测 将胰腺组织制备成10%匀浆液，采用ELISA 法，按说明书操作分别检测胰腺组织中ATP酶、线粒体呼吸链ComplexⅠ、Ⅲ活性及ROS、ATP含量。

1.5.3 Western blotting 法检测胰腺组织NRF1 和Mfn1 蛋白表达 将胰腺组织剪碎后，加入RIPA 裂解液，置于研磨器中低温充分研磨，0℃下静置1 h。1.2×104r/min，4℃，离心10 min。吸取上清液，BCA蛋白定量、煮蛋白。制备SDS-PAGE 凝胶，上样、电泳、转膜、封闭，加入一抗NRF1（1∶1 000）、Mfn1（1∶1 000）、β-actin（1∶3 000），4 ℃下静置孵育12 h；TBST 液洗涤，加二抗（1∶2 000），室温下慢摇1 h，TBST 液洗涤，ECL 发光液显色，曝光。GelDoc EZ凝胶电泳成像分析系统对目标蛋白灰度/内参灰度进行灰度。

1.6 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差()表示。多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐性，进一步采用Bonferroni 法进行两两比较；若方差不齐，采用Kruska-Wallis H秩和检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 5组小鼠FBG、FNS水平比较

与空白对照组比较，模型组小鼠给药后的FBG明显升高、血清中FNS 含量减少（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，二甲双胍组、杜仲黄酮组小鼠FBG 均降低，血清中FNS 含量增加（P＜0.05）；杜仲黄酮高剂量组FBG 水平显著低于低剂量组，血清FNS水平高于低剂量组（P＜0.05），见表1。

表1 5组小鼠FBG、FNS水平比较，n=10

表1 5组小鼠FBG、FNS水平比较，n=10

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与二甲双胍组比较，& P＜0.05，& & P＜0.01；与杜仲黄酮高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.2 5组小鼠抗氧化因子及ROS含量比较

与空白对照组比较，模型组小鼠胰腺T-AOC含量减少，SOD、CAT 活性降低，ROS 含量增加（P＜0.05）；与模型组比较，二甲双胍组、杜仲黄酮组小鼠胰腺T-AOC含量增加，SOD、CAT活性提高，ROS含量减少（P＜0.05）；杜仲黄酮高剂量组较低剂量组TAOC 含量及SOD、CAT 活性高，ROS 含量少（P＜0.05或P＜0.01），见表2。

表2 5组小鼠抗氧化因子及ROS含量比较，n=10

表2 5组小鼠抗氧化因子及ROS含量比较，n=10

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与二甲双胍组比较，& P＜0.05，& & P＜0.01；与杜仲黄酮高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.3 5组小鼠线粒体功能因子水平比较

与空白对照组比较，模型组ATP 含量明显降低，Complex Ⅰ、Ⅲ、ATP 酶活力减弱（P＜0.05 或P＜0.01）；与模型组比较，二甲双胍组、杜仲黄酮组小鼠胰腺ATP 含量明显增加，Complex Ⅰ、Ⅲ、ATP酶活力增强（P＜0.05）；杜仲黄酮高剂量组较低剂量组ATP 含量及Complex Ⅰ、Ⅲ、ATP 酶活力高（P＜0.05），见表3。

表3 5组小鼠线粒体功能因子水平比较，n=10

表3 5组小鼠线粒体功能因子水平比较，n=10

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与二甲双胍组比较，& P＜0.05，& & P＜0.01；与杜仲黄酮高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

2.4 5 组小鼠胰腺组织NRF1、Mfn1 蛋白表达量比较

与空白对照组比较，模型组胰腺NRF1、Mfn1蛋白表达量显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，二甲双胍组、杜仲黄酮组小鼠胰腺线NRF1、Mfn1蛋白表达明显升高（P＜0.05）；杜仲黄酮高剂量组较低剂量组NRF1、Mfn1蛋白表达高（P＜0.05或P＜0.01），见表4、图1。

表4 5组小鼠胰腺组织NRF1、Mfn1蛋白表达量比较，n=10

表4 5组小鼠胰腺组织NRF1、Mfn1蛋白表达量比较，n=10

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与二甲双胍组比较，& P＜0.05，& & P＜0.01；与杜仲黄酮高剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

图1 Western blotting蛋白电泳图

3 讨论

研究表明，杜仲黄酮在治疗骨质疏松、急性肺损伤及糖尿病方面有显著疗效，并均有降血压、降血脂、抗肿瘤、强筋健骨及降血糖等丰富药理作用[6]。最新研究表明，杜仲黄酮可纠正糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱，通过改善氧化应激状态对胰岛细胞及肾脏组织具有保护作用，但其潜在作用机制尚未完全明确[3,7]。研究认为，线粒体氧化应激产生的过多ROS 是导致胰岛素抵抗、β 细胞结构受损及功能障碍的关键因素[8-9]。因此，本研究旨在深入研究杜仲黄酮抗糖尿病机制是否与改善线粒体功能，减少ROS产生所致的氧化应激相关。

线粒体是机体的能量代谢中心，在不同的生理或病理状态下，线粒体具有调节其功能及在不同内环境下调整能量供应的能力[10]。胰岛素抵抗（IR）及T2DM病程的进展与线粒体功能异常有着重要的关系[11]。胰腺组织线粒体的肿胀、外膜破裂、线粒体DNA 损伤、呼吸链抑制等，线粒体生成和氧化磷酸化能力下降，会造成能量代谢障碍，形成一系列相互作用的损伤过程[12]。

线粒体代谢失衡是造成胰腺代谢功能异常的重要原因。线粒体的氧化还原反应平衡遭到破坏时，过量的强氧化分子ROS 生成，组织内氧化和抗氧化系统之间的动态平衡被打破[13]。ROS的异常堆积，氧化应激损伤破坏其内部的蛋白、线粒体DNA和线粒体膜上脂类，酶类、呼吸链复合物活性及氧化磷酸化水平降低，其合成ATP的能力下降，GSK-3蛋白激酶的蛋白质磷酸化效率降低，进而影响胰岛素信号通路、葡萄糖代谢、胰岛β细胞功能等胰腺代谢功能，可导致T2DM 的发生及发展[14-15]。T-AOC能反应机体抗氧化能力及脂质过氧化损伤程度，其在机体中的含量与机体的抗氧化能力呈正相关。Complex Ⅰ、Ⅲ是位于线粒体内膜的线粒体呼吸链酶，对线粒体活性氧及终端的电子受体的生成有着重要的作用。本研究结果表明，杜仲黄酮能提高T2DM 小鼠血清中抗氧化因子T-AOC 含量及增加SOD、CAT 的活性，同时增加胰腺线粒体中Complex Ⅰ、Ⅲ及ATP 酶活性及ATP 含量，降低ROS 的含量。提示，杜仲黄酮能提高机体的抗氧化能力及降低ROS的含量，恢复线粒体正常的代谢功能。

胰岛细胞线粒体数量下降是糖尿病发病及病程进展的重要条件[16]。研究表明，T2DM 患者胰腺中线粒体体积、数目明显低于正常人，可认为线粒体分裂与融合的动力学状态失衡，而线粒体分裂融合动力学的失衡是引起胰岛素抵抗，诱发T2DM 形成的始动因素之一[17]。线粒体生物合成因子和融合因子的表达在一定程度上代表线粒体的数量及功能状态，是平衡线粒体呼吸所产生的氧自由基的量，保证膜结构完整及维持正常膜电位，防止细胞凋亡的重要因子[18]。线粒体间的融合依赖于定位于线粒体外膜的融合蛋白Mfn1。当Mfn1 受损时，增加ROS 的生成，进一步加重线粒体功能障碍[19]。线粒体生物合成因子NRF1广泛参与线粒体的生物合成，与核基因启动子结合，正性调控基因转录，增加线粒体生成数量[20]。本研究结果表明，杜仲黄酮能增加胰腺中NRF1、Mfn1蛋白表达。提示，杜仲黄酮能调节胰腺组织中线粒体生物合成因子和融合因子的表达。

综上所述，杜仲黄酮能降低T2DM 小鼠血糖，增加血清胰岛素、T-AOC含量及CAT、SOD活性，同时增加胰腺中ATP含量及ATP酶、ComplexⅠ、Ⅲ活力，减少ROS 含量，提高NRF1 和Mfn1 蛋白表达。杜仲黄酮抗T2DM 的作用机制可能为干预线粒体融合与分裂、减少ROS 生成及堆积、提高机体抗氧化能力、增加胰腺线粒体数量及提高线粒体的代谢功能有关。