超高效液相色谱-串联质谱法快速测定毒蕈中6种鹅膏毒肽类和鬼笔毒肽类毒素

薛康 胡江涛 俞凌云 刘菲 马丽 龚婷婷 华燚 陈佳玥

摘要 [目的]建立一种基于超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）快速测定野生毒蕈中6种鹅膏毒肽和鬼笔毒肽类毒素的分析方法。[方法]将采集的四川野生毒蕈子实体低温烘干，用甲醇超声提取，40 ℃旋转蒸发近干，加水复溶，Oasis HLB固相萃取小柱净化，经Waters HSS T3色谱柱分离，ESI正离子模式下多反应监测（MRM）方式分析。[结果]6种毒肽在50～1 000 μg/kg具有良好的线性关系，相关系数均大于0.99，方法检出限为30 μg/kg。α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽、羧基三羟鬼笔毒肽在低、中、高3个浓度的平均回收率在93.1%～117.5%，变异系数（CV）在1.49%～7.77%。[结论]该方法能准确、灵敏地测定野生毒蕈中6种毒肽，适用于野生菌中毒肽毒素的测定。

关键词 野生毒蕈;鹅膏毒肽;鬼笔毒肽;超高效液相色谱-串联质谱法

中图分类号 R155.3 文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2021）17-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.048

Abstract [Objective]To establish a method for rapid determination of 6 kinds of amanitins and phallotoxins in wild poisonous mushrooms by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.[Method]The wild mushrooms samples collected in Sichuan were dried at low temperature， the amanitins and phallotoxins in samples were extracted with methanol by ultrasonic extraction， then 40 ℃ rotary evaporation drying ，water redissolution， purified by HLB solid phase extraction column and separated on Waters HSS T3 column，lastly detected by electrospray（ESI+） in MRM mode. [Result] The 6 kinds of amanitins and phallotoxins had good linear relationships in the range of concentration 50-1000 μg/kg with the correlation coefficient value greater than 0.99.The detection limits of 6 kinds of amanitins and phallotoxins were 30 μg/kg.The average recovery rates of α-amanitin， β-amanitin，γ-amanitin， phalloidin， phallacidin and phallisacin at 3 spiked levels were 93.1%-117.5%. The coefficients of variation were 1.49%-7.77%. [Conclusion]The method can accurately and sensitively determine 6 kinds of amanitins and phallotoxins in poisonous mushrooms， which is suitable for the detection of amanitins and phallotoxins in wild mushrooms.

Key words Wild poisonous mushrooms;Amanitins;Phallotoxins;UPLC-MS/MS

毒蕈即日常所说的毒蘑菇，是指不同类型的含有毒素的大型野生真菌，由于有些毒蕈在外观上与食用菌没有明显区别，导致误食毒蕈而引發中毒的事件时有发生，且在群体性食物中毒中，毒蕈中毒的致死率极高，其中肝损伤型毒蕈中毒致死率高达90%～100%[1]。据统计，我国毒蕈中毒事件中，95%是由鹅膏菌属引起的[2]。因为鹅膏菌中含有化学性质稳定且毒性极强的鹅膏多肽类毒素，该类毒肽耐高温、干燥和酸碱环境，一般的烹调加工不会破坏其毒性，不幸误食后，毒肽就会通过消化系统进入肝脏，对肝脏造成严重的损伤，最终引发多器官功能衰竭而死亡[3-5]。现阶段，国内外一般采用高效液相色谱法、高效液相色谱-飞行时间质谱法和高效液相色谱-串联质谱法检测毒肽毒素[6-11]，我国还没有检测毒肽毒素的国家标准。因此，该研究建立了一种利用超高效液相色谱-串联质谱法快速测定野生毒蕈中6种毒肽毒素的检测方法，以期为野生菌毒素检测提供一种高效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

UPLC lclass-XEVOTQ-XS超高效液相色谱-串联质谱联用仪（美国Waters公司）;3H20RI离心机（中国赫西）;AE240电子天平（瑞士梅特勒）;XW-80A旋涡混合器（中国HUXI）;B8510E-DTH超声波清洗器（美国必能信）;Mili-Q Integral 3超纯水仪（美国Millipore公司）;ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美国Waters公司）。

1.2 试剂 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸铵、氯仿，HPLC级，美国Fisher公司。标准品：α-鹅膏毒肽（α-amanitin，纯度≥90%，瑞士Alex）;β-鹅膏毒肽（β-amanitin，纯度≥90%，瑞士Alex）;γ-鹅膏毒肽（γ-amaniyin，纯度≥90%，瑞士Alex）;羧基三羟鬼笔毒肽（phallisacin，50 μg/mL，上海安谱实验科技有限公司）;羧基二羟鬼笔毒肽（phallacidin，纯度≥95%，瑞士Alex）;二羟鬼笔毒肽（phalloidin，纯度≥90%，瑞士Alex）。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液的配制。

1.3.1.1 α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔毒肽标准储备液的配制。 分别精确称取α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽、羧基二羟鬼笔5种标准物质1 mg，精确至万分之一，甲醇定容至10 mL，浓度为100 μg/mL。-20 ℃存储。

1.3.1.2 鹅膏毒肽和鬼笔毒肽混合标准使用液的配制。分别准确吸取1.0 mL α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽、γ-鹅膏毒肽、二羟鬼笔毒肽和羧基二羟鬼笔毒肽储备液以及2.0 mL羧基三羟鬼笔毒肽标准溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，浓度为10 mg/L。

1.3.1.3 6种毒肽混合标准系列的配制。分别吸取50、100、200、400、600、1 000 μL，用初始流动相定容至10 mL，配制成浓度为50、100、200、400、600、1 000 μg/L的标准系列工作液。

1.3.2 样品前处理。

1.3.2.1 提取。将新鲜野生菌样品烘干（烘干温度小于50 ℃）并打成粉末，精密称取干燥粉末0.2 g，置于50 mL离心管中，加入甲醇10 mL，振荡涡旋1 min，超声提取10 min，以10 000 r/min离心10 min后，移取上清液于另一离心管中。残渣中再加入10 mL甲醇，涡旋混合均匀，再次超声提取10 min后以10 000 r/min离心，合并上清液。40 ℃旋转蒸发近干，加2 mL水溶解，洗涤3次，得提取液。

1.3.2.2 净化。分别用2 mL甲醇和纯水淋洗活化Prime Oasis HLB固相萃取柱（3 mL，60 mg），再将以上提取液过柱，用2 mL含5%甲醇的水溶液淋洗2次，最后用2 mL甲醇-乙腈混合溶液（V∶V=3∶2）洗脱。将洗脱液在40 ℃水浴中氮吹近干，用1 mL初始流动相[甲醇-5 mmol/L 乙酸铵（0.1%甲酸）=90∶10]溶解定容，溶液过0.2 μm滤膜后，待上机测定。

1.3.3 分析条件。

1.3.3.1 色谱条件。色谱柱为HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司）;流动相 A为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液， B为甲醇溶液;柱温40 ℃;进样量1.0 μL;洗脱程序见表1。

1.3.3.2 质谱条件。电喷雾ESI正离子模式;多反应监测（MRM）;离子源温度150 ℃;毛细管电压2.83 kV;脱溶剂温度550 ℃;脱溶剂气流量1 000 L/h;其他质谱参数见表2。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

鹅膏毒肽属双环八肽，鬼笔毒肽是一类环状七肽，其支链上有较多的羟基和甲基，容易接受电子而被离子化，故常采用正离子模式进行分析[6，12]。分别将6种毒肽的标准品用甲醇稀释成500 ng/mL，质谱仪直接进样，在ESI正离子MS1Scan模式下，发现6种毒肽都有较强的M+1离子峰的出现，因此选定M+1为母离子，在Daughter Scan模式下，分别找到每种毒肽的2个最佳子离子。最后优化锥孔电压、碰撞能、脱溶剂气流量、脱溶剂气温度等质谱参数，使离子化效率更高、离子强度最大。具体6种毒肽的母离子和子离子见表2。

2.2 色谱条件的优化 试验选择了UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），此色谱柱是与100%水相相兼容的C18柱，对保留和分离极性有机小分子具有较为理想的效果。该试验选择研究了4组流动相（A组水-乙腈;B组水-甲醇;C组0.1%甲酸水-甲醇;D组5 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）-甲醇）的分离效果，试验表明，甲醇的分离效果比乙腈好，且使用5 mmol/L乙酸铵（0.1%甲酸）作为水相时，目标物的离子峰强度较高，峰形较好。6种毒肽的標准提取离子图详见图1。

2.3 样品前处理方法的优化

由于野生菌中成分复杂，脂肪、磷脂、肽类等杂质含量较高，该试验采用了先溶剂提取、再固相萃取柱净化的方法，先后比较了甲醇、水、乙腈3种溶剂的提取效果，结果表明，甲醇的提取效果较好，回收率高。

试验考察了在使用HLB固相萃取柱净化过程中，5%甲醇-氯仿和5%甲醇-水淋洗液的淋洗效果，结果表明，5%甲醇-氯仿淋洗液对HLB小柱中吸附的脂肪、磷脂等杂质具有较好的洗脱效果，但回收率较差。综合考虑，该试验采用5%甲醇-水作为淋洗液。

2.4 线性范围与检出限 6种毒肽的线性方程、线性范围和线性相关系数见表3。以3倍信噪比（S/N≥3）估算检出限（LOD），6种毒肽的检出限为30 μg/kg。

2.5 方法回收率和精密度

取1份样品，分别对6种毒肽进行低（50 μg/kg）、中（200 μg/kg）、高（600 μg/kg）浓度加标试验，结果发现（表4），平均回收率分别为α-鹅膏毒肽99.5%～

117.5%，β-鹅膏毒肽93.4%～107.0%，γ-鹅膏毒肽94.2%～110.1%，二羟鬼笔毒肽108.5%～119.8%，羧基二羟鬼笔毒肽 93.5%～109.7%，羧基三羟鬼笔毒肽93.1%～106.5%;6次平行测定，变异系数（CV）在1.49%～7.77%。

2.6 野生菌样品检测 按上述方法对采集到的10个四川野生菌样品进行前处理和检测。在4号和6号样品中检出了α-鹅膏毒肽、β-鹅膏毒肽和二羟鬼笔毒肽3种毒蕈毒素，具体结果见表5，谱图见图2和图3。

3 结论

该研究基于超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS/MS），采用甲醇提取， HLB固相萃取柱净化，HSS T3 色谱柱分离，电喷雾ESI正离子模式和多反应监测（MRM）方

式对6种毒蕈毒素的目标离子进行监测，外标法定量，建立了6种毒蕈毒素的快速、准确、选择性好的测定方法。该方法与传统的色谱法的检测时间（20 min）相比，大大缩短了检测时间，同时具备更高的准确度、灵敏度和特异性，适用于野生菌中毒肽毒素的测定。

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