蚯蚓粪中微生物群落特征分析

宋晓贺, 李彦凯，宋亚玲, 郑彦坤, 侯振林，于道平

(安庆师范大学 生命科学学院，水生生物保护与水生态修复安徽省高等学校工程技术研究中心,安徽 安庆 246133)

蚯蚓粪是蚯蚓对其生活周围环境的有机物进行利用和降解的产物，是一种含有多孔团粒状结构的细碎类物质，含有丰富的放线菌、细菌、真菌、植物生长激素和酶类物质等，具有形状均一、表面积大和持水能力强等特点，在生菜、玉米等作物育苗及生长上表现出良好效果，可用于缓解番茄、黄瓜、西瓜等经济作物连作障碍和土壤微生物生态系统修复.

土传病害是指主要发生在植物根部且病原菌通过土壤传播而引起的病害.土传病害由于病原菌可在土壤中存活数年且具有隐蔽性，其防治往往非常困难.蚯蚓粪中含有大量有益微生物，且不存在在土壤中存活定殖难的问题.因此，蚯蚓粪在土传病害防控中具有很大的应用潜力.Szczech在生长介质中加入蚯蚓粪后，西红柿根腐病受到了抑制.胡艳霞等从蚯蚓粪中分离获得2株拮抗微生物菌球——孢链霉菌(

Streptomyces

globisporus

)和丁香苷链霉菌(

S.

syringini

)，对黄瓜苗期立枯病和枯萎病具有显著抑制作用.Gopalakrishnan等从蚯蚓粪中分离获得5株对镰刀菌有拮抗作用的细菌，它们能够有效防控鹰嘴豆枯萎病.王胜等将蚯蚓粪作为底肥，有效地控制了油菜根肿病的发生与危害.为检验蚯蚓有机肥对铜陵白姜生长特性、产量及对姜瘟病抑制效果的影响，笔者团队连续3年进行田间生长测试和姜瘟病发生机制研究，结果显示，施用蚯蚓肥的铜陵白姜，长势良好，茎粗壮，肉质肥厚，产量增加，姜瘟病的发病率降低.研究表明，蚯蚓粪作为生物防治成分能在一定程度上抑制土传病害的发生，蚯蚓粪中有益微生物在调控土传病害中发挥重要作用.

高通量测序技术具有高灵敏度、高准确性和低运行成本的特点，能够深入、细致地研究微生物群落结构，已被广泛应用于多种生态系统的微生物多样性研究.然而，关于蚯蚓粪中微生物的群落结构鲜有报道.该文利用ITS和16S rRNA高通量测序技术检测蚯蚓粪中真菌和细菌群落的种类和数量，为进一步开发利用蚯蚓粪中微生物资源、探索其在植物土传病害生物防治方面的作用提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

蚯蚓粪取自合肥诚汇生态农业有限公司.蚯蚓品种为赤子爱胜蚓(

Essential

fetide

).在常温下使用牛粪饲养蚯蚓20 d后挑选刚产生的尚未干燥、颜色为黑色、大小均匀的新鲜蚯蚓粪便，用镊子轻轻夹入无菌的保鲜袋中，6次重复，4 ℃冷藏运送至实验室，放入-80 ℃冰柜保存备用.

1.2 基因组DNA的提取

参照Omega Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒使用说明书，将6组蚯蚓粪充分混合均匀，提取蚯蚓粪宏基因组DNA.用琼脂糖凝胶检测DNA完整性.

1.3 蚯蚓粪细菌16S rRNA和真菌ITS高通量测序

PCR扩增及高通量测序采用的细菌引物为带Barcode 的16S rRNA 基因V3-V4通用引物341F：5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3和805R：5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′.真菌引物为带Barcode的ITS1-2通用引物ITS1F：5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA3′和ITS2R：5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC3′.PCR反应体系为：2×Taq master Mix 15 μL、正反向引物(10 μmol·L)各1 μL、Genomic DNA (1 ng·μL)10 μL(5～10 ng)，补水至总体积30 μL.PCR反应程序：98 ℃预变性1 min；5个循环(94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s)；20个循环(94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 10 min.4 ℃保存.各样本重复3次，同一样本PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物.利用NOVA PE250进行16S rRNA高通量测序，Miseq 2x 300 bp进行ITS高通量测序，委托生物工程(上海)股份有限公司完成.对原始数据进行预处理，根据97%的相似度对序列进行OUT聚类，选取高质量的序列进行分析.

1.4 数据处理与生物信息学分析

对原始测序数据进行质量控制，根据接头Barcode序列拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列.之后去除嵌合体序列，得到最终的有效数据.利用Uparse软件对所有样品的全部有效数据进行聚类，在97%序列相似度水平上计算OTU的数量.利用Qiime软件计算Alpha多样性指数，包括Chao1指数、香农指数(Shannon index)、Simpson指数、Goods-coverage指数和ACE指数.采用RDPclassifier软件将前述各样品合格序列进行物种分类操作，阈值设置为0.8，低于该阈值的分类结果被划归为unclassified一类，统计样本物种门、纲、目、科、属、种的群落组成.

2 结果与分析

2.1 样品测序结果及微生物群落多样性分析

蚯蚓粪样品的数据和OTUs数目统计见表1.供试样本测序共产生249 653条原始序列，质控后得到249 364条高质量的目标片段.207 331序列用于构建OTUs并且获得注释信息.在97%的序列一致性水平上，共获得注释信息的序列聚类成11 951 OTUs，细菌和真菌含有的OTUs数目分别为：10 218和1 733.

表1 蚯蚓粪高通量测序注释结果统计和Alpha多样性指数

蚯蚓粪微生物群落的丰富度和多样性评估可用Chao1指数、香农指数、ACE指数和覆盖率.

由表1可知，文库覆盖率接近1，说明测序数据量能够真实地反应样品细菌和真菌的多样性.蚯蚓粪细菌Chao1指数、香农指数和ACE指数均显著高于真菌的，说明蚯蚓粪中细菌群落不仅丰度最大，而且物种的数量也最多.

2.2 蚯蚓粪细菌菌群结构特征

细菌群落共检测到34个菌门，其中序列占比在0.01%及以上细菌菌门有28个，相对丰度最大的优势菌门为变性菌门Proteobacteria，占39.55%，其次为拟杆菌门Bacteroidetes(13.37%)、酸杆菌门Acidobacteria(9.79%)、放线菌门Actinobacteria(9.36%)、浮霉菌门Planctomycetes(9.02%)(图1(a)).在目的水平上共检测到123个类群，其中丰度大于5%的有3个，分别为浮霉状菌目Planctomycetales、根瘤菌目Rhizobiales、噬纤维菌目Cytophagales(图1(b)).未分类和未知类群共占37.26%.在属的水平上，共有693个类群被分类到，其中平均丰度大于1%的有Gp6、

Ohtaekwangia

、纤维素降解菌

Chryseolinea

、

Demequina

、芽单胞菌属

Gemmatimonas

、

Phaeodactylibacter

、

Aridibacter

、黄杆菌属

Flavobacterium

等12个，未分类和未知类群共占70.89%.

图1 在门(a)和目(b)水平上蚯蚓粪细菌群落相对丰度

2.3 蚯蚓粪真菌菌群结构特征

真菌群落高通量测序共检测到9个门(图2(a)).罗兹菌门Rozellomycota和子囊菌门Ascomycota为优势门，分别占31.55%和24.38%.在目的水平上，丰度在0.01%及以上者有26个，优势目为粪壳菌目Sordariales，占12.67%，其次为Togniniales 和小子囊菌目Microascales，分别占3.59%和3.48%(图2(b)).罗兹菌门真菌未鉴定到目.未知分类占32.4%.在属种的水平上，共检测到243个属147种，其中平均丰度大于0.05%的属有16个，分别为尾柄孢壳属

Cercophora

(6.61%)、

Phaeoacremonium

(3.59%)、柄孢壳菌

Podospora

(1.07%)、孢壳属

Zopfiella

(1.19%)、热链球菌属

Mycothermus

(0.05%)、红光树属

Kemia

(0.24%)、丝孢菌属

Scedosporium

(0.09%)、镰刀菌属

Fusarium

(0.42%)、枝顶孢属

Acremomium

(0.12%)、

Plectosphaerella

(0.12%)、曲霉菌属

Aspergillus

(0.61%)、嗜热真菌属

Thermomyces

(0.09%)、茎点霉属

Phoma

(0.07%)、念珠菌属

Candida

(0.06%)、被孢霉菌

Mortierella

(0.55%)、鬼伞属

Coprinellus

(0.1%).

图2 在门(a)和目(b)水平上蚯蚓粪真菌群落相对丰度图

3 讨 论

蚯蚓粪自身含有大量有益微生物，有促进土壤微生物生长以及酶活性提高的作用.笔者的研究首次利用16S rRNA 和ITS高通量测序技术，系统分析蚯蚓粪中细菌和真菌群落的特征.研究中检测到大量的微生物，在细菌群落中，91%的OTUs被注释到门的分类单元，67%的OTUs被注释到科的分类单元，49%的OTUs被注释到属的分类单元.在真菌群落中，有32%的OTUs被注释到门的分类单元，20%的OTUs被注释到科的分类单元，16%的OTUs被注释到属的水平.究其原因，蚯蚓粪中存在很大比例的未知分类地位和未知功能的微生物，这些微生物可能是目前还不能进行人工培养的微生物，这些不可培养微生物还未被广泛认识.另外，利用传统微生物分离培养法分离到一些细菌和真菌属，在高通量测序中可能并无显示或者丰度很低，这可能是由于一些微生物多以孢子的形式存在，而在总DNA提取过程中对其裂解不充分导致.即使如此，通过结果可看出利用16S rRNA和ITS高通量测序技术研究蚯蚓粪微生物组在测序数目和注释分析上都是可行的.

蚯蚓粪是一种优质、安全的天然有机肥料，对土壤环境质量和作物生长具有明显的改善和促进作用，在土传病害防控中具有很大的应用潜力.笔者团队前期研究发现蚯蚓粪对铜陵白姜具有的促生作用和对姜瘟病的抑制作用，推测是蚯蚓粪中有益微生物发挥的重要作用.笔者的研究目的是尝试利用微生物组的新技术挖掘和寻找蚯蚓粪中有益微生物资源，揭示蚯蚓粪抑制姜瘟病发生的作用机理.结果发现，在蚯蚓粪中存在大量可以用来防治植物病害的微生物.在真菌群落中，检测到大量的有益生防真菌，比如肉座菌目Hypocreales中的木霉属

Trichoderma

、绿僵菌属

Metarhizium

、粘帚霉属

Gliocladium

，这些属的真菌广泛分布于土壤中，是非常重要的植物寄生真菌、昆虫寄生真菌和植物共生真菌.而粪壳菌目Sebacinales中的毛壳菌属

Chaetomium

中大多数种产生活性强的纤维素酶，能有效降解纤维素和有机质，并对土壤中的其他微生物产生拮抗作用.同时检测到Saccharomycetales、Tremellales、Sporidiobolales和Filobasidiales 4个目中5个属酵母菌的存在，即念珠菌属

Candida

、隐球菌属

Cryptococcus

、线黑粉酵母属

Filobasidium

、掷孢酵母属

Sporobolomyces

、毕赤酵母属

Pichia

，这些属的酵母菌中均存在可以用来控制植物病害的生防菌.此外，还检测到5个属锈菌的重寄生菌和1个属的白粉寄生孢，分别是支顶孢属

Acremonium

、单端孢属

Trichothecium

、柱隔孢属

Ramularia

、链格孢属

Alternaria

、镰刀菌属

Fusarium

和白粉寄生孢

Ampelomyces

quisqualis

，是锈菌和白粉菌上常见和重要的重寄生菌.在蚯蚓粪细菌群落中共检测到693个属的存在，有一些是可以用来防治植物病害的生防细菌.厚壁菌门Firmicutes的芽孢杆菌属

Bacillus

，拟杆菌门Bacteroidetes的假单胞菌属

Pseudomonas

、黄杆菌属

Flavobacterium

和短杆菌属

Brevibacterium

，变形菌门Proteobacteria的

Stenotrophomonas

、假黄色单胞菌属

Pseudoxanthomonas

、沙雷氏菌属

Serratia

和

Brevundimonas

，这些属的细菌是土壤和植物根际微生物的优势种群，也是常见的植物内生细菌，不仅可以防治植物病害，还能增加产量.此外，还检测到具有生防潜力的放线菌门的链霉菌属

Streptomyces

、小单孢菌属

Micromonospora

、放线菌属

Actinomyces

、游动放线菌属A

ctinoplanes

、马拉杜放线菌属

Actinomadura

，其中链霉菌属丰度最高.这些微生物的存在，为植物土传病害和土壤改良提供新的思路和资源，为进一步研究蚯蚓粪生态学功能提供有益的指导和理论基础研究.