NPC人群VMAT治疗前后鼻咽部菌群多样性变化

张静,李鹏,黄杰,黄静

(1 武汉市普仁医院耳鼻喉头颈外科,湖北 武汉 430081； 2 武汉亚心总医院普外科；3 武汉市普仁医院肿瘤治疗中心一病区； 4 武汉市普仁医院护理部)

鼻咽癌(NPC)是临床常见的鼻咽部恶性肿瘤，多发于我国华南地区[1]。目前，放射疗法是临床治疗NPC的首选方法。然而，放疗会引发口腔念珠菌感染、溃疡性黏膜炎、牙龈炎及放射性中耳炎等多种并发症[2]。有报道指出，这些并发症的产生和放疗导致病人鼻咽部细菌菌群发生改变密切相关[3]。在放疗方法中，调强放疗应用最为广泛，其中容积弧形动态调强放射治疗(VMAT)具有可变机架转速、运动精准快速及可变剂量率的多叶准直器等功能，可以在治疗过程中连续旋转而被逐渐应用于NPC的治疗[4]。然而，对VMAT治疗后病人鼻咽部细菌菌群变化则鲜有研究报道[5]。此外，虽然放疗方案对病人鼻咽部菌群结构产生明显影响，而菌群多样性是评估菌群结构的重要指标之一，但放疗方案对菌群多样性的影响仍鲜有报道[6-8]。本研究对NPC人群采用VMAT进行治疗，观察治疗前后病人鼻咽部细菌菌群变化，从而探讨VMAT与鼻咽部微生物构成及变化之间的关系，旨在为NPC放疗效果的改善及并发症的降低提供依据。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

经武汉市普仁医院伦理委员会批准，将该院2016年3月—2019年7月间收治的符合入组及排除标准的117例病人作为观察组，其中男63例、女54例，年龄19～72(41.28±6.74)岁。依照AJCC第8版分期标准[9]：T2N1M0期72例，T3N2M0期45例。VMAT治疗周期6～7周，放疗剂量68.40～74.00 Gy/30～33 f。入组标准：①经病理学检查确诊为NPC；②均接受VMAT治疗方案；③无严重营养不良；④KPS评分均>90分；④对本研究知情并签署知情同意书。排除标准：①合并免疫系统功能异常；②入组前1个月内有益生菌、抗生素、微生态活菌、益生元等服用史；③心肝肾等脏器功能异常或器质性疾病；④合并严重营养不良；⑤存有远处转移病灶；⑥主动申请退出本研究。选取50例行普通放疗方案治疗的NPC病人作为对照组，其中男28例，女22例，年龄20～73(42.01±7.13)岁。T2N1M0期31例，T3N2M0期19例。

1.2 VMAT方法

观察组病人均采取仰卧位并用热塑膜固定头颈肩。采用Elekta 16排螺旋CT进行定位，勾画包括鼻咽部大体肿瘤区(GTV)、高危临床靶区(CTV1)、低危临床靶区(CTV2)以及阳性淋巴结区(GTVnd)等靶区。各靶区均向外拓展5 mm。危及器官主要有脑干、垂体、脊髓、视神经、视交叉、晶体以及腮腺等。其中GTV处方剂量为70 Gy，CTV1为60 Gy，CTV2为54 Gy，GTVnd为66 Gy。采用Monaco计划系统(Elekta公司)对病人进行VMAT计划。对照组病人采用常规放疗方案治疗，先在前后颈切线照射36～40 Gy，后垂直两侧颈垂直照射，参与病灶追加10～20 Gy，分段治疗，中间休息4周，每周照射5次，每次2 Gy。

1.3 样本采集及处理方法

本研究中在所有病人放射治疗前及治疗结束1周后采用灭菌鼻咽拭子加套管采集鼻咽部样本，避免鼻腔污染，保证采集样本可靠性以真实反映局部细菌群落情况。使用核酸提取试剂盒并结合超声破碎法及溶菌酶裂解法提取DNA。利用1492R和8F引物对16SrRNA基因可变区进行扩增，反向引物1492R(5′-GYTACCTTGTTACGACTT-3′)使用CY2荧光标记，正向引物8F(5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′)使用FAMTM荧光标记。依照试剂盒说明书方法进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶纯化并回收16SrRNA特异性PCR扩增产物。以HhaⅠ/MspⅠ限制性内切酶对纯化后产物进行酶切处理，采用ABI 3100型遗传分析仪对酶切产物进行测序，取50 RFU荧光强度作为基线，使用GeneScan Version 3.7软件对T-RFLP图谱进行分析。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 观察组病人器官剂量调查

调查结果显示，观察组病人采用VMAT治疗过程中其器官受辐射剂量基本符合各部位限制剂量。见表1。

表1 观察组病人器官VMAT治疗剂量调查

2.2 两组鼻咽部菌群多样性指数检测

治疗前后鼻咽部菌群调查结果显示，观察组病人共得到139种不同T-RFs片段，治疗前共94种，治疗后45种，且治疗前鼻咽部菌群多样性指数以D最高，H最低。对照组病人共得到110种不同T-RFs片段，治疗前89种，治疗后21种。治疗前两组病人T-RFs数量比较，差异无显著性(P>0.05)。与治疗前相比较，观察组治疗后E明显升高(t=17.675，P<0.001)，对照组治疗后E和D明显降低(t=18.592、24.707，P<0.001)。观察组治疗后E和D较对照组明显升高，差异均有统计学意义(t=13.293、58.657，P<0.001)。两组治疗前后E和D的差值比较，差异具有显著性(t=58.135、121.766，P<0.001)。见表2。

表2 两组病人鼻咽部菌群多样性指数检测

2.3 T-RFLP图谱样品间相似性系数比较

本文研究结果显示，观察组放射治疗前后T-RFLP图谱样品间相似性系数为0.57，对照组为0.22，两组比较差异有统计学意义(χ2=8.494，P<0.05)。

2.4 VMAT治疗与病人鼻咽部细菌菌群多样性的相关性

采用Forword模式进行变量分析和筛选显示，病人治疗时的照射部位及采用VMAT计划均是影响鼻咽部细菌菌群多样性的独立性影响因素(χ2=9.262、10.410，P<0.05)，照射位置正常病人的细菌多样性是非正常的2.02倍，采用VMAT照射病人的细菌多样性是常规照射的1.982倍。见表3、4。

表3 变量赋值表

表4 NPC病人VMAT治疗后菌群多样性的Logistics回归分析

3 讨 论

NPC是临床常见的恶性肿瘤之一，其多发于鼻咽腔顶和侧壁，发病率位于耳鼻咽喉肿瘤之首[10-11]。NPC的发病因素主要包括遗传、病毒感染以及环境等，主要临床症状有鼻塞、听力下降、视力障碍、头痛等[12]。因NPC对放射治疗较为敏感，因此放射治疗成为NPC的首选疗法。目前临床常用的放疗手段有腔内近距离放疗、伽玛刀放疗、三维适形放疗等，其中适形调强放疗因其疗效显著而被广泛应用于NPC的治疗，其可以在杀死癌细胞的同时，保护周围组织而减少并发症的发生[13-15]。然而，在常规的静态调强放疗过程中，病人体位会发生改变，导致治疗时间延长而影响最终治疗效果[16-17]。VMAT具有可变机架转速、运动精准快速及可变剂量率的多叶准直器等功能，以其在病人周围旋转的锥形束射线来实现放射治疗，因而不受病人体位改变的影响，且其剂量率、机架转速和子野形状可以根据临床实际需求进行改变，从而可以更好地保护病人脑干、脊髓等重要器官[18-19]。放疗后照射区域的链球菌属、葡萄球菌属、白色念珠菌和绿脓杆菌等检出增加，而放线菌属和奈瑟菌属检出减少。

虽然放射治疗可以有效杀死肿瘤细胞，但同时会对周围组织造成创伤而出现不良反应[20-22]。常见的放疗后并发症有中耳炎、口腔黏膜反应、骨髓抑制、放射性皮炎以及恶心呕吐等[23-24]。虽然有多篇文献报道，给予病人恰当的护理可有效降低并发症的发生概率，但是无法从根本上预防并发症的发生[25-27]。有研究表明，在放射治疗过程中病人鼻咽部细菌菌群生长会发生改变，此时持续照射会加剧局部炎症反应从而导致并发症的发生[28-29]。

本文研究结果显示，病人采用VMAT治疗过程中其器官受辐射剂量基本符合各部位限制剂量。观察组病人共得到139种不同T-RFs片段，治疗前共94种，治疗后45种，且治疗前鼻咽部菌群多样性指数以D最高，H最低，放疗治疗前后T-RFLP图谱样品间相似性系数为0.57。本文研究结果还显示，NPC病人在治疗前其鼻咽部菌群结构相对较为复杂，且菌群多样性高、菌群种类丰富，物种优势大。病人采用放射治疗后其鼻咽部菌群会出现明显改变。研究显示，相较于传统放疗方案，采用VMAT方案对病人进行干预后可改善T淋巴细胞和吞噬细胞数量，有效避免病人全身抵抗力降低[30]。本文结果还显示，照射位置正常病人的细菌多样性是非正常的2.02倍，采用VMAT照射病人的细菌多样性是常规照射的1.982倍；观察组放射治疗前后T-RFLP图谱样品间相似性系数为0.57，对照组为0.22。其原因可能为采用VMAT对NPC病人干预，可降低黏膜机械保护功能损伤和咽部物理屏障损害，避免厌氧菌的生长定植，改善菌群多样性[31]。

本研究观察NPC人群采用VMAT治疗前后鼻咽部细菌菌群变化结果表明，经VMAT治疗后NPC病人鼻咽部细菌菌群出现显著改变。有研究结果显示，放疗会改变NPC病人口腔菌群结构和数量，且会损伤腮腺，放疗造成菌落结构改变、优势菌丰度变化与放疗后并发症的发生密切相关[32-33]。本研究结果表明，NPC病人行VMAT后鼻咽部细菌菌群总数减少，菌群多样性降低。且照射部位及VMAT均是影响病人鼻咽部细菌菌群多样性的独立性影响因素。本文结果为VMAT的临床应用提供了数据支持。然而，本研究也存在如下不足之处：①本研究仅对病人鼻咽部进行取样来观察细菌菌群的变化，没有搜集牙齿菌斑及唾液，其样本来源比较单一，研究结果仅能客观反映鼻咽部的菌群变化；②本研究主要采用T-RFLP技术分析菌落结构变化及多样性特点，而不能实现菌属的定性；③本研究并未对病人治疗过程中的菌群变化情况进行动态监测，且为前期探索，样本量较少，不具有广泛代表性，且结果可能因为小样本出现偏差。今后将扩大样本的种类与数量，并采用多样化分析检测技术对放疗前后NPC病人细菌菌群变化进行探索，深入全面地揭示放射与细菌菌群之间的关系，为减少NPC放射治疗并发症、提高治疗效果提供依据。