HAS2和PTGS2在牦牛不同时期卵巢中的表达与定位

高泽川，赵 凌，潘阳阳，何翃闳，刘敏清，杨姗姗，赵 天，崔 燕，余四九，王 萌，秦玉洁

(1 甘肃农业大学 a 生命科学技术学院，b 动物医学院，甘肃 兰州 730070；2 金昌市永昌县六坝镇农业农村综合服务中心，甘肃 金昌 737204)

牦牛(Bosgrunniens)是起源于中国的原始物种，主要分布在青藏高原及其周围海拔3 000 m以上的高原地区[1]，其适应高寒、低氧能力较强，但生育能力较为低下[2]，且流产率高，从而严重影响了牦牛的繁殖[3]。卵母细胞在生殖过程中有重要作用，卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes,COCs)是影响卵母细胞发育成熟的关键因素。透明质酸合成酶2(HAS2)和前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)是在促黄体素(luteinizing hormone，LH)激增后诱导的对卵丘扩展至关重要的2种酶，分别调控透明质酸(hyaluronicacid2，HA)和前列腺素(如前列腺素E2，prostaglandinE2，PGE2)的合成[4]。

HAS有HAS1、HAS2和HAS3等3种亚型[5]，其催化所产生的HA分子量大小不一，HAS1和HAS3催化合成的HA分子质量为2×105～2×106u，而HAS2催化合成的HA分子质量大于2×106u。HAS2是HA合成的关键酶，也是卵丘扩展的关键酶，而HA是构成卵丘基质的主要结构骨架。卵丘细胞在成熟过程中合成的HA对其自身扩增以及卵母细胞的成熟和胚胎的进一步发育都是必不可少的[6]。PTGS2又称环氧化酶-2(COX-2)，是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)转化为前列腺素(PGs)的关键酶，前列腺素在调节发情周期、妊娠识别、妊娠维持和分娩中起着关键作用[7]，可影响黄体溶解素PGF2α和黄体生成素PGE2的表达，同时还参与黄体生成和退化的调节[8]。有研究表明，缺少PTGS2的小鼠不能排卵，并且有异常的着床和蜕膜反应[9]，缺乏PTGS2和PGE2受体EP2(e-series of prostaglandin receptors type ，EP2)的小鼠，由于COCs扩增缺陷导致不孕[10]。以上研究显示，HAS2和PTGS2对雌性动物的生殖具有重要作用。

目前，国内外关于HAS2、PTGS2的研究主要集中在人类和小鼠上，而关于其在牦牛卵巢中的表达研究尚未见报道。本试验以临床健康牦牛不同时期的卵巢为试验材料，运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western blotting和免疫组织化学法(immunohistochemistry，IHC)检测HAS2和PTGS2在牦牛卵泡期、黄体期和妊娠期卵巢中的表达及分布情况，为进一步提高牦牛生育能力提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在青海省西宁市乐家湾屠宰场采集年龄相近的成年健康雌性牦牛卵巢，按照何翃闳等[11]的方法对卵巢进行分类。卵泡期卵巢：优势卵泡>6 mm，子宫有黏液和弹性；黄体期卵巢：卵巢可见多个黄体；妊娠期卵巢：解剖见子宫中有胎儿(约2.3 cm)。取不同时期卵巢各5颗用于试验。用质量分数0.9%的无菌生理盐水将卵巢冲洗干净并分为两份，一份置于液氮中保存，备用；另一份样品修剪成1 cm3的小块，置于质量分数4%多聚甲醛中固定，常温保存备用。

1.2 主要试剂和仪器

HAS2和PTGS2抗体以及免疫组化试剂盒，二抗(Goat Anti-Rabbit IgG)，北京博奥森生物技术有限公司；Tranzol试剂，北京Omega公司；GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒，Go Taq®Green Master Mix 2×，美国Promega公司；蛋白裂解液，北京索莱宝公司；SYBR®Premix Ex TaqTMEraserTM(Tli RNaseH Plus)，宝生物(TaKaRa)公司。阳离子蛋白免疫印迹所用试剂均来自碧云天生物技术有限公司(南京)，阳离子防脱片来自中杉金桥公司(北京)。

仪器：PCR仪(美国RioRad公司)，荧光定量PCR仪(瑞士Roche公司)，显微照相仪(DP71,日本Olympus)。

1.3 引物设计及特异性检验

根据GenBank数据库中牛HAS2、PTGS2基因和牦牛β-actin基因的mRNA信息(GenBank登录号分别为NM_174079.3、NM_174445.2和DQ838049.1)，用Primer Premier 6.0软件设计引物(表1)，引物由上海生工基因科技公司合成。

表1 试验所用引物信息Table 1 Primer information used in the experiment

用Tranzol试剂提取牦牛卵泡期、黄体期和妊娠期卵巢组织总RNA，使用GoScriptTMReverse Transcription System试剂盒将总RNA反转录形成cDNA，-20 ℃保存。以cDNA为模板，扩增HAS2、PTGS2和β-actin基因。PCR反应体系为20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，Go Taq®Green Master Mix 2×10 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，检测引物的特异性。

1.4 HAS2和PTGS2的mRNA表达水平检测

采用qRT-PCR检测HAS2和PTGS2的m-RNA表达水平。qRT-PCR反应体系20 μL：cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，SYBR®Premix Ex TaqTMEraserTM10 μL，ddH2O 6.4 μL。具体反应条件为： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每个样品重复3次，反应结束后观察采集扩增曲线和溶解曲线，保存循环阈值(Ct)，得到数据用2-ΔΔCt方法进行统计学分析。

1.5 HAS2和PTGS2蛋白表达水平检测

采用Western blotting检测HAS2和PTGS2蛋白表达水平。将液氮中保存的各时期卵巢样品低温研磨成粉末，取0.1 g置于1.5 mL离心管中并加入裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF)，涡旋后在冰上裂解3 h，4 ℃下15 000 r/min离心7 min之后取上清液，将提取的蛋白置于-80 ℃保存。向蛋白原液中加入1/3体积的4×上样缓冲液，混合均匀，100 ℃变性10 min，冷却至室温，保存备用。

制备8%分离胶和5%浓缩胶，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，电泳结束后根据所需目的条带大小对照Maker切胶，湿转法将蛋白转移到PVDF膜上，用50 g/L的脱脂奶粉室温下封闭2 h;4 ℃下一抗(1∶1 000倍稀释)孵育过夜，PBST清洗条带3次， 10 min/次；室温下二抗(Goat Anti-rabbit IgG/HRP antibody，1∶1 000倍稀释)孵育1 h，PBST清洗条带3次，10 min/次;滴加化学发光液，曝光PVDF膜，扫描蛋白印迹条带;每组重复3次。利用Image J软件对Western blotting条带的灰度值进行分析，确定HAS2和PTGS2的表达水平。

1.6 HAS2和PTGS2蛋白在不同时期卵巢中的分布检测

采用IHC法检测HAS2和PTGS2蛋白在牦牛不同时期卵巢中的分布情况。将固定好的卵巢样品常规方法制备厚4 μm的石蜡切片，脱蜡，在PBS和蒸馏水中依次浸泡5 min。将切片置于柠檬酸盐缓冲液中抗原修复，微波炉大火加热至沸腾,持续15 min后冷却至常温，PBS清洗3次，5 min/次。擦去切片周围的水分，滴加质量分数3%的H2O2试剂覆盖组织进行阻断，在37 ℃温箱内孵育15 min，PBS清洗3次，5 min/次。擦去切片周围水分，滴加SP试剂盒中的A液进行封闭，在37 ℃温箱孵育15 min。擦去切片周围水分，分别以Rabbit Anti-HAS2 antibody、Rabbit Anti-PTGS2 antibody为一抗(用PBS进行1∶250倍稀释)滴加覆盖到组织上，4 ℃过夜，PBS清洗3次，5 min/次。擦去切片周围水分，滴加SP试剂盒中的B液，37 ℃温箱孵育15 min，PBS洗3次，5 min/次。擦去切片周围水分，滴加SP试剂盒中的C液，37 ℃温箱孵育15 min，PBS清洗3次，5 min/次。擦去切片周围水分，将显色液滴加到组织上进行DAB显色，显微镜下观察显色情况，显色合适立即浸入自来水终止显色，自来水冲洗10 min，蒸馏水浸泡3 min，苏木精复染2 min，盐酸酒精分化5 s，自来水反蓝10 min，脱水透明，树脂封片，显微镜拍照。以PBS代替一抗的处理为阴性对照。

1.7 数据统计与分析

采用SPSS 19.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析，每组重复3次。P<0.05表示差异性显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 耗牛HAS2、PGTS2和β-actin基因扩增引物特异性的检测

用2%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，结果表明，HAS2、PTGS2和β-actin引物均扩增到与目的片段长度相同的条带(图1)，表明引物特异性良好。

M.DNA Marker DL2000；1.卵泡期卵巢扩增产物 2.黄体期卵巢扩增产物 3.妊娠期卵巢扩增产物M.DNA Marker DL2000；1.Amplification products of follicularovary 2.Amplification products of luteal ovary3.Amplification products of pregnancy ovary图1 牦牛PTGS2、β-actin和HAS2基因扩增引物的特异性检测Fig.1 Specific detection of PTGS2,β-actin and HAS2 gene amplification primers in yak

2.2 牦牛不同时期卵巢中HAS2、PTGS2基因mRNA的表达情况

qRT-PCR检测结果(图2)显示，牦牛不同时期卵巢中均检测到HAS2、PTGS2基因mRNA的表达，其中黄体期卵巢HAS2和PTGS2 mRNA的相对表达量显著高于卵泡期卵巢和妊娠期卵巢(P<0.05)，卵泡期卵巢HAS2和PGTS2 mRNA的相对表达量均显著高于妊娠期卵巢(P<0.05)。该结果表明，HAS2、PTGS2基因在牦牛不同时期卵巢中的表达水平存在显著差异。

图柱上标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).The same below图2 牦牛不同时期卵巢中HAS2和PTGS2基因mRNA的表达情况Fig.2 Expression of HAS2 and PTGS2 mRNA in yak ovaries at different stages

2.3 牦牛不同时期卵巢中HAS2、PTGS2蛋白的表达情况

Western blotting结果(图3，图4)显示，HAS2、PTGS2蛋白在牦牛不同时期卵巢中均有表达，且表达水平存在显著性差异(P<0.05)。其中黄体期卵巢HAS2的相对表达量显著高于其他2个时期(P<0.05)，妊娠期卵巢HAS2的相对表达量显著高于卵泡期(P<0.05)；黄体期卵巢PTGS2蛋白的相对表达量显著高于卵泡期和妊娠期(P<0.05)，卵泡期卵巢PTGS2的相对表达量显著高于妊娠期(P<0.05)。该结果表明，在牦牛不同时期卵巢中，HAS2和PTGS2蛋白的表达量均有显著差异。

1.卵泡期卵巢;2.黄体期卵巢;3.妊娠期卵巢1.Follicular ovary;2. Luteal ovary;3.Pregnancy ovary图3 牦牛不同时期卵巢中 β-actin、HAS2和PTGS2蛋白的表达情况Fig.3 Expression of β-actin、HAS2 and PTGS2 protein in yak ovary at different stages

图4 牦牛不同时期卵巢中HAS2和PTGS2蛋白的表达情况Fig.4 Expression of HAS2 and PTGS2 proteins in yak ovaries at different stages

2.4 牦牛不同时期卵巢中HAS2和PTGS2蛋白的分布情况

免疫组织化学染色结果(图5和图6)显示，HAS2、PTGS2蛋白在牦牛不同发育时期卵巢中均有表达，表达产物呈棕褐色；HAS2 和PTGS2蛋白主要分布在卵巢的卵泡颗粒层、卵丘细胞与黄体细胞中。

SG.卵泡颗粒层；CC.卵丘细胞；CL.黄体细胞 SG.Follicle granular layer；CC.Cumulus cell；CL.Luteal cell 图5 HAS2在牦牛不同时期卵巢中的分布情况Fig.5 Expression of HAS2 in yak ovaries at different stages

SG.卵泡颗粒层； CC.卵丘细胞； CL.黄体细胞SG.Follicle granular layer；CC.Cumulus cell；CL.Luteal cell图6 PTGS2在牦牛不同时期卵巢中的分布情况Fig.6 Expression of PTGS2 in yak ovaries at different stages

3 讨 论

卵巢是雌性动物生殖系统中的重要器官，主要功能是产生卵子(外分泌)和类固醇激素(内分泌)。本研究通过分析牦牛不同时期卵巢中HAS2与PTGS2的表达与分布，进一步证实了不同时期卵巢中HAS2与PTGS2的相对表达量具有显著差异，提示HAS2和PTGS2可能在牦牛繁殖中发挥着重要作用。本研究qRT-PCR试验结果表明，HAS2基因在牦牛黄体期卵巢中的表达量最高，卵泡期卵巢次之，妊娠期卵巢最低；Western blotting 试验结果表明，HAS2蛋白在黄体期卵巢中的相对表达最高，妊娠期卵巢次之，卵泡期卵巢最低；免疫组织化学染色结果表明，HAS2蛋白主要分布在卵丘细胞、颗粒细胞和黄体细胞中。卵母细胞的成熟对雌性动物生殖极其重要，但并不是所有卵泡都可以发育成熟，大部分卵泡在发育不同阶段逐渐退化[12]。卵丘细胞和颗粒细胞对卵母细胞的生长发育有着十分重要的作用[13-18]，在促性腺激素激增后，HAS2 mRNA在卵丘细胞中强烈表达，并控制卵丘扩展[19]。且有研究发现，HAS2蛋白在马、小鼠和牛卵巢的颗粒细胞和卵丘细胞中表达[20-21]，这提示卵泡期卵巢中HAS2的表达可能参与调控卵丘细胞的扩张。有研究表明，卵丘细胞HAS2在发育质量较高的卵丘卵母细胞复合体中的表达量，显著高于发育质量较低的卵丘卵母细胞复合体[22]，表明卵泡期HAS2的表达对卵母细胞发育很重要。本研究中HAS2在卵丘细胞和颗粒细胞中均有表达，推测其可能参与调控牦牛卵丘扩展及卵母细胞的生长发育成熟。

在黄体期和妊娠期卵巢中，HAS2在黄体细胞中表达，黄体细胞分泌孕酮刺激子宫内膜发育、增厚，为受精卵成功着床提供必需的条件。妊娠早期孕酮不足会造成胚胎发育不良，如不及时补充，会导致胎儿停止发育、流产等；妊娠中晚期孕酮不足会导致早产。有研究发现，与正常小鼠相比，外源性孕酮可提升卵巢切除小鼠子宫中的HA水平[23]，故推测HAS2在黄体细胞中的表达可能参与黄体细胞中孕酮的分泌。胚胎生长过程中，HAS2是合成HA的重要酶，敲除小鼠HAS2基因对胚胎存活和生长不利，在胚胎发育各个时期HAS2均有表达，但其表达量随胚胎发育时期的推进逐渐降低[24]，故推测HAS2对牦牛胚胎存活和生长具有一定作用。

本试验qRT-PCR结果发现，黄体期卵巢PTGS2基因mRNA的相对表达量显著高于卵泡期和妊娠期卵巢，卵泡期卵巢显著高于妊娠期卵巢；Western blotting 结果发现，黄体期卵巢PTGS2蛋白的相对表达量显著高于其他2个时期，卵泡期卵巢次之，妊娠期卵巢最低；免疫组织化学染色结果表明，PTGS2蛋白在卵丘细胞、颗粒细胞和黄体细胞中均有表达。PTGS2参与PGs的合成，参与调节许多生殖活动，如排卵、黄体退化、着床和妊娠的建立[25]。有研究发现，PTGS2蛋白主要定位于颗粒细胞、卵丘细胞和黄体细胞[26-28]，这与本研究结果一致。PTGS2衍生的PGE2在排卵调控中发挥关键作用[29]，与卵母细胞核成熟呈正相关[9]，内源性促黄体素激增可上调排卵前卵泡中PTGS2的表达[30-31]。小鼠模型证明，卵泡期COCs中PTGS2的高水平表达是由PTGS2衍生的前列腺素和表皮生长因子的反馈回路引起的[32]。在猪体内，卵泡期卵巢中PTGS2的表达上调会提高卵母细胞发育成熟的能力[33]，故卵泡期PTGS2的表达对卵母细胞发育具有促进作用。据此推测，本研究牦牛卵泡期卵巢PTGS2表达可能参与调节卵母细胞的成熟。有学者发现，黄体期PTGS2上调对黄体的维持和退化起着重要的调节作用[8]，促黄体素刺激PTGS2上调使黄体细胞产生前列腺素，这有助于维持黄体功能，而PTGS2不足会使残余卵泡转化为黄体的能力下降[34]。据此推测，本研究牦牛黄体期卵巢PTGS2上调可能参与调控卵巢黄体的形成和退化。在妊娠期，胚泡着床和黄体维持依赖PTGS2的存在，PTGS2是高质量胚胎发育的关键[35-36]。在整个妊娠周期，PTGS2持续存在[37]，前人研究表明，PTGS2在黄体早期表达量最高，中期表达量显著降低，退行期表达量略有增加，到妊娠期表达量再次降低[27]，故推测牦牛妊娠期黄体中PTGS2的表达，可能与黄体的维持和胚胎的发育有一定作用。