杨柴种子萌发对环境因子的响应研究

王志恒，杨秀柳，胡 韩，徐中伟，周吴艳，黄思麒，帕提古丽·热合曼，魏玉清

(北方民族大学 生物科学与工程学院 国家民委生态系统模型及应用重点实验室，宁夏 银川 750021)

杨柴(Hedysarumleave)别名羊柴，豆科岩黄芪属多年生落叶半灌木，主要分布在我国半干旱、干旱地区的毛乌素沙地、库布齐沙漠、浑善达克沙地和科尔沁沙地[1]。作为西北地区生长的典型沙生灌木树种，杨柴是荒漠化防治的理想植物，同时也是适口性好的优良饲料[2-3]。飞播技术是一项快速而有效的现代化治沙措施，已成为荒漠化土地植被重建与逆转的重要手段[4]。杨柴作为毛乌素沙地不同植被演替阶段的优势物种之一，是飞播使用的主要物种，在飞播治沙中得到广泛使用[4]。生产实践中，种子能否顺利萌发及幼苗能否顺利出土与定居,是飞播成功与否的关键，其中温度、光照、土壤水分和种子埋藏深度为主要环境影响因子[5]。因此，研究飞播植物种子的萌发机制，有助于理解其在自然生态系统及植被恢复中的机制，同时有利于飞播技术的改善[6]。

种子萌发是荒漠植物生活史中对环境生态因子最为敏感的阶段，关系到其进入生态系统的时间，进而影响荒漠植物的分布多样性[7-9]。适宜温度是种子萌发和出苗的基础条件[10-11],有些植物种子的萌发受到光照和温度的共同作用[12]。有研究表明，恒温22.5 ℃和变温20/30 ℃为杨柴种子萌发的最适温度， 100 μmol/(m2·s)为最适光照强度[1,6,11]。沙埋深度是影响荒漠植物种子萌发的另一关键因素，适度沙埋可以促进种子萌发，不同的沙埋深度会引起种子周围水、热、光、气等环境因子的变化，从而影响种子萌发[13]。土壤含水量过高或过低均导致种子发芽率降低[14]，沙埋深度与土壤含水量的共同作用会影响种子正常萌发[15]。聂春雷等[16]研究发现，杨柴萌发与出苗最适宜的供水量接近于当地种子萌发时期的平均降水量(50 mm)；姜联合[6]研究指出，0.5 cm沙埋可使杨柴幼苗很好出土，当种子埋藏过深或仅在沙土表面时很难萌发。沙地植物在完成生活史的过程中，经常遭受水盐胁迫，因而水分和盐分常会成为其种子萌发的限制因子[17-18]。因此，本研究分析了光照、温度、土壤含水量、沙埋深度、渗透势及盐碱环境因子对杨柴种子萌发的影响，以期阐明环境因子对杨柴种子萌发的影响特征，为毛乌素沙地杨柴飞播时机的选择和种子萌发率的提高提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

杨柴种子购自宁夏远声绿阳草业生态工程有限公司。试验开始前将种子用体积分数10%的次氯酸钠溶液浸泡20 min，用无菌水冲洗7～8次，直至干净无味，用滤纸吸干种子表面水分后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 不同光照条件下温度对杨柴种子萌发的影响 试验在室内智能人工气候箱(上海博讯，BIC800)内进行，光通量密度100 μmol/(m2·s)，相对湿度50%。温度(高温/低温)设置15/10，20/15，25/20，30/25，35/30 ℃共5个梯度(其中高温和低温作用时间均为12 h)。采用锡纸包裹培养皿控制光照，设2种光照处理：光照处理(每隔12 h 光暗交替1次，下文简称“光照”，光照/黑暗情况与高温/低温条件相对应)和黑暗处理(用双层锡箔纸包裹培养皿模拟全部黑暗条件，下文简称“黑暗”)。将30粒杨柴种子整齐摆放在直径120 mm垫有双层滤纸的培养皿中，每个培养皿加入10 mL蒸馏水，均设置3个重复。试验期间每天更换培养基质，以保证培养环境的恒定，以胚根伸出种皮2 mm为萌发标准，记录种子萌发数，10 d后结束试验。

1.2.2 不同土壤含水量条件下沙埋深度对杨柴种子萌发的影响 试验在室内智能人工气候箱(上海博讯，BIC800)内进行，温度25/20 ℃(光照/黑暗)，光通量密度100 μmol/(m2·s)。取北方民族大学生物科学与工程学院实习基地内多年种植小麦的熟化风沙土，过筛去除杂质后，120 ℃ 下烘干36 h，使可能存在的其他种子失活，自然冷却后加入蒸馏水，使沙中含水量分别为5%，10%，15%，20%，25%。每个土壤含水量处理对应设6个沙埋深度(0，1，2，3，4，5 cm)，然后用塑料圆柱形容器(内径10.2 cm，高15.0 cm)装沙到拟放置种子的高度，除0 cm处理外，其余均在播种后覆上沙土，并使沙表面保持水平。试验期间每天改变容器位置，使各容器受光一致。以幼苗出现第1片真叶作为萌发标准[13]，记录种子萌发数，15 d后结束试验。

1.2.3 干旱和盐碱胁迫对杨柴种子萌发的影响 将PEG-6000配制成0(CK，蒸馏水)，-0.05，-0.10，-0.15，-0.20，-0.25，-0.30，-0.35，-0.40，-0.50，-0.60 MPa共11个梯度；将NaCl配制成0(CK，蒸馏水)，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%，2.0%，2.4%共11个梯度；将NaHCO3配制成0(CK，蒸馏水)，0.04%，0.08%，0.12%，0.16%，0.20%，0.24%，0.28%，0.32%，0.40%，0.48%共11个梯度。按1.2.1节的方法处理杨柴种子。渗透势和盐碱胁迫下的发芽率符合函数三参数S型模型[19]，拟合模型如下：

G=Gmax/{1+exp[-(x-x50)/k]}×100%。

式中：G表示在盐碱水平或渗透势下的发芽率，Gmax为最大发芽率，x指渗透势或盐碱水平，x50是抑制最大发芽率达50%时的盐碱水平或渗透势，k表示斜率。

1.2.4 测定指标及方法 试验过程中，每隔24 h观察记录种子萌发情况；萌发试验结束后，从每个处理中随机选出15株幼苗，用直尺测量早期幼苗长度。按以下公式[13]计算各指标：

发芽率=萌发种子数/供试种子数×100%；

萌发速率=∑100Gt/nDt；

活力指数=∑Gt/Dt×S。

式中：Gt代表Dt天的萌发或出苗数量，n代表每个处理种子数量，S为早期幼苗平均长度。

1.3 数据处理

采用 Microsoft Excel 2003进行数据统计处理，SPSS Satatistics 21.0进行二因素方差分析以及不同土壤含水量下杨柴种子萌发参数与沙埋深度间的回归分析；三参数S型模型利用软件Matlab建立函数模型，采用最小二乘法拟合，并对种子萌发率与渗透势、NaCl水平和NaHCO3水平的关系进行曲线拟合；采用GraphPad Prism 5.0和Origin Pro 9.0 进行差异显著性分析和作图，试验数据以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同光照条件下温度对杨柴种子萌发的影响

光照和温度对杨柴种子萌发参数的影响如图1所示。

图柱上不同小写字母表示在同一光照条件下不同温度处理间存在显著差异(P<0.05)，不同大写字母表示同一温度条件下不同光照处理间存在显著差异(P<0.05)Different lowercase letters indicate significant differences among temperature treatments under same light conditions (P<0.05),and different uppercase letters indicate significant differences among light treatments under same temperature conditions (P<0.05)图1 光照和温度对杨柴种子萌发参数的影响Fig.1 Influence of light and temperature on germination parameters of Hedysarum leave seeds

由图1可知，在光照条件下，杨柴种子的发芽率、萌发速率和活力指数均随温度升高呈先上升后下降趋势，15/10，20/15，25/20和30/25 ℃ 下杨柴种子的发芽率显著高于35/30 ℃ (P<0.05)；20/15，25/20和30/25 ℃下杨柴种子的萌发速率和活力指数显著高于15/10和35/30 ℃ (P<0.05)。在同一温度条件下，黑暗条件下杨柴种子的发芽率、萌发速率和活力指数均高于光照条件下，且活力指数的差异均达显著水平(P<0.05)。

由表1可以看出，光照、温度以及二者的交互作用对杨柴种子的萌发参数均具有显著影响。光照、温度和光照×温度对杨柴种子的发芽率、萌发速率和活力指数的贡献度不同，以温度对发芽率的贡献度最大(89.59%)，光照×温度次之(5.34%)，光照最小(5.07%)；温度对萌发速率的贡献度也最大(89.56%)，光照次之(10.22%)，光照×温度最小(0.22%)；温度对活力指数的贡献度仍最大(70.30%)，光照次之(24.48%)，光照×温度最小(5.22%)。可见，温度是影响杨柴种子萌发的主要因子，而光照与温度的交互作用对杨柴种子萌发参数的影响较小。

表1 光照和温度对杨柴种子萌发影响的二因素方差分析Table 1 Two-factor analysis of variance on influence of light and temperature on germination of Hedysarum leave seeds

2.2 不同土壤含水量条件下沙埋深度对杨柴种子萌发的影响

由图2和图3可知，在5%和10%土壤含水量条件下，杨柴种子发芽率、萌发速率和活力指数均随着沙埋深度的增加表现为先增大后减小的趋势，均在1 cm沙埋深度下最大，且5%土壤含水量下沙埋深度1 cm的萌发参数显著大于0 cm (P<0.05)；在15%和20%土壤含水量条件下，发芽率和萌发速率均随着沙埋深度的增大逐渐减小，且5 cm沙埋深度显著小于0 cm (P<0.05)；在25%土壤含水量条件下，除0 cm沙埋深度外，其余沙埋深度杨柴种子均未萌发。

图柱上不同小写字母表示在同一土壤含水量下不同沙埋深度处理间存在显著差异(P<0.05)，不同大写字母表示同一沙埋深度下不同土壤含水量处理间存在显著差异(P<0.05)。图3同Different lowercase letters indicate significant difference between treatments with different sand burial depths under same soil water content (P<0.05),and different uppercase letters indicate significant difference between different soil water treatments with same sand burial depth (P<0.05).The same as Fig.3

图3 土壤含水量和沙埋深度对杨柴种子活力指数的影响Fig.3 Effects of soil water content and sand burial depth on vigor index of Hedysarum leave seeds

由表2可以看出，土壤含水量、沙埋深度以及二者交互作用对杨柴种子的萌发参数均具有极显著影响。其中，土壤含水量对发芽率的贡献度最大(59.31%)，土壤含水量×沙埋深度次之(23.37%)，沙埋深度最小(17.32%)；土壤含水量对萌发速率的贡献度也最大(35.53%)，沙埋深度次之(33.21%)，土壤含水量×沙埋深度最小(31.26%)；土壤含水量×沙埋深度对活力指数的贡献度最大(37.06%)，土壤含水量次之(32.11%)，沙埋深度最小(30.83%)。可见，土壤含水量是影响杨柴种子发芽率和萌发速率的主要因子，而土壤含水量和沙埋深度的交互作用是影响活力指数的主要因子。

表2 土壤含水量和沙埋深度对杨柴种子萌发影响的二因素方差分析Table 2 Two-factor analysis of variance on influence of soil water content and sand depth on germination of Hedysarum leave seeds

为了进一步明确杨柴种子萌发阶段土壤含水量与沙埋深度的关系，将不同土壤含水量情况下的萌发参数与沙埋深度进行曲线回归分析。结果(图4-6)显示，除10%土壤含水量下发芽率、萌发速率与沙埋深度间的回归模型为二次曲线模型外，其余均为三次曲线模型；其中10%土壤含水量下的发芽率和萌发速率、15%和20%土壤含水量的萌发参数回归模型均达到显著水平(P<0.05)。

图4 不同土壤含水量下杨柴种子发芽率与沙埋深度的关系Fig.4 Relationship between seed germination percentage and sand burial depth of Hedysarum leave under different soil water contents

图5 不同土壤含水量下杨柴种子萌发速率与沙埋深度的关系Fig.5 Relationship between seed germination rate and sand burial depth of Hedysarum leave under different soil water contents

分别以杨柴种子在不同土壤含水量条件下15 d后的发芽率为因变量(y1)，以沙埋深度为自变量(x)建立线性回归方程，将发芽率达到75%,50%和10%代入线性回归方程，得出所对应的沙埋深度依次为适宜沙埋深度、半致死沙埋深度和极限致死沙埋深度。因此，10%土壤含水量下，杨柴种子的半致死沙埋深度为0.7 cm，极限致死沙埋深度为4.9 cm；15%土壤含水量下，杨柴种子的适宜沙埋深度为0.3 cm，半致死沙埋深度为4.6 cm，极限致死沙埋深度为6.2 cm；20%土壤含水量下，杨柴种子的适宜沙埋深度为1.3 cm，半致死沙埋深度为4.8 cm，极限致死沙埋深度为5.9 cm。

表3 不同土壤含水量下杨柴种子萌发参数与沙埋深度的回归方程Table 3 Regression equations between Hedysarum leave seed germination parameters and sand depth under different soil water contents

2.3 干旱和盐碱胁迫对杨柴种子萌发的影响

2.3.1 干旱胁迫的影响 由图7可知，CK和渗透势高于-0.30 MPa各处理种子发芽率基本均在80%以上，无显著差异；当渗透势低于-0.40 MPa时种子发芽率有显著下降趋势；当渗透势为-0.40～-0.20 MPa时，尽管种子的萌发速率缓慢，而且活力指数显著低于CK处理，但发芽率依然可达60%以上。以上结果表明，随着渗透势的降低，虽然杨柴种子萌发总体上受到明显抑制，但渗透势为-0.40 MPa时仍有60%左右的种子可以萌发。

不同小写字母表示在不同处理间存在显著差异(P<0.05)。下同Different lowercase letters indicate significant differences between treatments (P<0.05).The same below图7 渗透势胁迫对杨柴种子萌发参数的影响Fig.7 Effects of osmotic potential stress on germination parameters of Hedysarum leave seeds

杨柴种子发芽率对渗透势的响应关系曲线方程为：G=85.598/{1+exp[(x+0.438)/-0.0518]}(R2=0.975) (图10-A)。通过模拟公式计算可知，种子萌发率为50%时的渗透势为-0.44 MPa；渗透势低于-0.50 MPa时，种子最终萌发率低于20%，且第3天才可观察到种子萌发。说明杨柴种子具有较强的抗旱性。

2.3.2 盐胁迫的影响 由图8可知，CK与NaCl水平低于0.6%处理的发芽率基本在70%以上，无明显差异；当NaCl水平高于0.8%时，种子发芽率有显著下降趋势；当NaCl水平在0.8%～2.0%时，尽管种子的萌发速率缓慢，而且活力指数显著低于CK处理，但发芽率仍在20%以上。以上结果表明，虽然总体上随NaCl水平的升高杨柴种子萌发受到明显抑制，但NaCl水平小于0.8%时仍有60%以上的种子可以萌发。

图8 盐胁迫对杨柴种子萌发参数的影响Fig.8 Effects of salt stress on germination parameters of Hedysarum leave seeds

杨柴种子发芽率对NaCl水平的响应关系曲线方程为：G=104.688/{1+exp[(x-0.930)/0.583]}(R2=0.959)(图10-B)。通过模拟公式计算可知，杨柴种子萌发率为50%时NaCl水平为0.93%；当NaCl水平为2.0%时，种子最终萌发率低于20%，且第4天才可观察到种子萌发。由此可见，杨柴种子具有较强的耐盐性。

2.3.3 碱胁迫的影响 由图9可知，与CK处理相比，不同水平NaHCO3处理的杨柴种子发芽率均显著降低，且随着NaHCO3水平的升高呈显著下降趋势；当NaHCO3水平在0.16%～0.40%时，尽管种子萌发速率较高，但活力指数显著低于CK处理，最终其发芽率均不超过50%，并且在试验中观察到种子萌发后死苗的现象，这可能是其萌发速率和活力指数变化不一致的原因。总体上，随NaHCO3水平的升高杨柴种子萌发受到明显抑制，且在NaHCO3水平超过0.16%时仅不到50%的种子可以萌发。

图9 碱胁迫对杨柴种子萌发参数的影响Fig.9 Effects of alkali stress on germination parameters of Hedysarum leave seeds

杨柴种子发芽率对NaHCO3水平的响应关系曲线方程为：G=109.658/{1+exp[(x-0.116)/0.0798]}(R2=0.981)(图10-C)。通过模拟公式计算可知，种子萌发率为50%时NaHCO3水平为0.116%；当NaHCO3水平为0.24%时，种子最终萌发率低于20%。说明杨柴种子萌发对NaHCO3较敏感。

图10 杨柴种子发芽率与渗透势及NaCl和NaHCO3水平的拟合曲线Fig.10 Fitting curves of germination rate of Hedysarum leave seeds with osmotic potentials,NaCl and NaHCO3 levels

3 讨论与结论

3.1 光照和温度对杨柴种子萌发的影响

光照和温度是调节种子萌发的重要环境信号，在决定种子萌发周期和物种分布方面起着关键作用[20-21]。通过调整光照可以控制种子发芽时间，这可能是早期幼苗存活以及之后生长和适应的关键因素[22-23]。在水分、盐碱度等因素胁迫下，若温度不合适，会通过影响种子活力直接影响发芽过程，从而影响发芽率[24]。本研究结果表明，20～30 ℃下，杨柴种子萌发快速且集中，光照条件下30/25 ℃ 为杨柴种子最适萌发温度，黑暗条件下25/20 ℃为杨柴种子最适萌发温度。前人研究表明，种子萌发对光照需求因植物种类而异，适宜光照对长芒草(Stipabungeana)[9]和南川绣线菊(Spiraearosthornii)[5]种子萌发具有促进作用；梭梭(Haloxylonammodendron)[25]、意大利苍耳(Xanthiumitalicum)[26]和胡杨(Populuseuphratica)[27]种子萌发对光照无严格需求；但油蒿(Artemisiaordosica)[12]、沙芥(Pugioniumcornutum)和斧翅沙芥(P.dolabratum)[28]等种子萌发在强光下均会受到抑制。本研究发现，相比于光照条件，黑暗条件对杨柴种子萌发具有促进作用，特别是温度条件不适时,黑暗对杨柴种子萌发的促进作用更大。即使杨柴在飞播时(晚春和早夏)的温度和土壤湿度都适于种子萌发，若此时缺乏足够的风力扬沙埋藏种子，使种子暴露在较强的光照条件下，导致其遭受干旱胁迫，则种子选择休眠；当遇上风沙活动使种子能够适度沙埋从而躲避强光直射后，种子才进行萌发与出苗。此外，根据姜联合[6]的报道，杨柴种子萌发不受光照影响，这与本研究结果不一致，差异原因有待进一步探讨。

3.2 土壤含水量和沙埋深度的交互作用对杨柴种子萌发的影响

土壤含水量和沙埋深度是荒漠地区种子萌发过程中重要的生态因子。飞播后的种子经常会遭受不同程度的沙埋，适宜沙埋可以将种子保护于土壤之中，减少种子周围水分的蒸发，从而保证种子发芽所需水分、温度和氧气等条件，利于种子萌发。种子埋藏较浅时，较强的光照、较大的温度波动和降雨后种子的干燥现象均会导致发芽率降低；埋藏过深时，种子周围的氧气流通较差和CO2含量较高，尤其在土壤含水量较高的情况下，土壤致病微生物种群大量增加，最终会抑制植物种子的萌发[6,13]。有研究表明，在同一土壤含水量条件下，适宜的沙埋深度有利于种子萌发。如蒿属半灌木的乌丹蒿(Artemisiawudanica)、白沙蒿(A.sphaerocephala) 和差不嘎蒿(A.halodendron)在土壤水分相同条件下，均在沙埋深度为1.5 cm时出苗率和出苗速率达到最大值，反映出沙埋深度与土壤水分间的交互作用[29]；沙米(Agriophyllumsquarrosum) 和长穗虫实 (Corispermumelongatum) 在首次供水1 139.8 mL、之后每天供水189.9 mL的情况下，沙埋1 cm更利于种子萌发；大果虫实 (Corispermummacrocarpum)在沙埋4 cm下种子萌发率最大，沙埋过浅或过深均不利于其种子萌发[30]。本研究发现，在5%和10%土壤含水量下，杨柴种子的萌发参数随着沙埋深度增加均呈现先增大后减小的趋势，且在1 cm沙埋深度下最大;20%和25%土壤含水量萌发参数均在0 cm最大，且随着沙埋深度的增加呈现逐渐减小趋势；说明杨柴种子沙埋深度较浅时萌发情况较好，这与在另2种飞播植物柠条锦鸡儿(CaraganakorshinskiiKom)[31]和梭梭(Haloxylonammodendron)[32]上的研究结果一致。在本研究中，不同土壤含水量下杨柴种子的萌发参数与沙埋深度间的回归关系有所不同，总体趋势是萌发参数与沙埋深度的相关性随土壤含水量的升高表现为先升高后下降，萌发参数与沙埋深度的相关系数在20%土壤含水量下较高，并且各萌发参数值也较大，表明在这一土壤含水量下杨柴种子对沙埋深度的适应性最强；二因素方差分析结果表明，土壤含水量与沙埋深度的交互作用显著影响杨柴种子的萌发参数，即适宜土壤含水量与沙埋深度的交互作用有利于种子萌发。毛乌素沙地的飞播于每年5月中下旬进行，此时沙地风沙活动较为频繁且强烈，种子有很大机会被沙埋并维持长期的萌发活力，在夏季来临前温度和降雨合适的情况下，种子就会迅速萌发；而适宜埋藏深度的种子萌发后会形成发育较好的根系，增强其水分利用能力和对温差变化的抵抗能力，进而提高幼苗成活率，可以保证飞播成效[33-34]。

3.3 干旱和盐碱胁迫对杨柴种子萌发的影响

在荒漠生态环境中，植物种子的延迟萌发是一种对不利环境的适应方式，提高了植物种子适应环境的能力[35]。土壤缺水或盐分过高均能限制延迟、减少或抑制种子发芽，并在植物以后的生长发育中产生影响[20]。本研究结果表明，不同程度的干旱胁迫、NaCl胁迫和NaHCO3胁迫均能抑制杨柴种子的萌发，但杨柴种子在重度干旱胁迫和NaCl胁迫下仍有萌发，表现出较强的抗旱和抗盐能力。在本研究中，随着NaCl和NaHCO3水平的升高，杨柴种子萌发参数下降幅度高于干旱胁迫，尤其是活力指数的受抑制程度十分明显；同时从3种胁迫下的杨柴种子发芽率拟合曲线可以看出，NaHCO3胁迫拟合曲线拐点出现最早，干旱胁迫出现最晚；以上说明杨柴种子对逆境胁迫的敏感程度依次为：NaHCO3胁迫>NaCl胁迫>干旱胁迫。这可能是由于较高的Na+浓度抑制了种子萌发第Ⅱ 阶段“迟滞期”DNA损伤修复、细胞骨架重建及萌发相关m-RNA和蛋白质的合成等代谢活动，从而影响后续细胞分化和扩大等重要的新陈代谢过程，导致种子未能或推迟进入第 Ⅲ阶段，最终影响种子萌发的完成[36-37]。已有研究表明，碱性盐胁迫对植物种子萌发的伤害要高于中性盐胁迫[38-39]，这在本研究中也得到了证实。